Hale人宫颈癌细胞的处理与培养及相关研究！
2023-02-06 10:41阅读：
Hale人宫颈癌细胞的处理与培养及相关研究！
一、背景及概述
HeLa是第一个来自人体组织经连续培养获得的非整倍体上皮样细胞系，它由Gey
GO等在1951年从31岁女性黑人的宫颈癌组织建立。传代方法：将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约0.5mL，移至培养箱消化，约3min取出。传代用12mL
CM1-1培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分3~6皿培养；生长条件：37，5%CO2，CM1-1培养液。CM1-1培养液：90%DMEM-H+10S。DMEM-H：DMEM高糖培养液，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠。存储条件：冻存则用6mL冻存液（90S+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为6支冻存管，用程序降温盒于-80冻存，过夜转移至液氮中保存。
二、细胞收到后处理
细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的
实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松）
三、细胞培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM
EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6
ml培养液的新皿中或者瓶中。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。
四、相关研究
王仕斌等人探究了右美托咪啶(Dex)对人宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法将细胞分为Hela组、Dex(1μM)组、Dex(2μM)组和Dex(5μM)组，分别用0，1，2，5μM的Dex处理细胞，用CCK8检测细胞增殖，Hoechst染色检测细胞凋亡，Transwell检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western
blot检测Ki67、Caspase-3、血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达。结果
Dex作用于细胞4
d后，Dex(1，2，5μM)组细胞增殖速度和Ki67表达水平与Hela组比较明显降低，细胞凋亡率和Caspase-3表达水平明显升高；同时，与Hela组比较，Dex(1，2，5μM)组侵袭细胞数明显减少，划痕闭合率及VEGF表达水平也明显降低；此外，Dex(1，2，5μM)还能显著降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值。结论
Dex能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活抑制人宫颈癌Hela细胞存活和转移。
孙卓等人研究了干扰PTEN表达对He
La细胞细胞周期分布的影响并探索其相关机制。方法:以人宫颈癌细胞系He
La为实验对象，利用慢病毒转染技术导入PTEN-特异性短发卡RNA(short hairpin RNA，sh
RNA)干扰PTEN表达，采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染前后PTEN及细胞周期蛋白Cyclin B1 m
RNA和蛋白的表达，流式细胞术检测细胞周期分布变化，蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后利用Western blot检测Cyclin
B1蛋白稳定性变化。结果:PTEN sh RNA作用He La细胞后，PTEN m
RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低；下调PTEN表达后，细胞周期中G2/M期细胞比例与对照组相比明显增加，Cyclin
B1蛋白表达水平下降，但Cyclin B1 m RNA水平与对照组相比无明显差异。MG-132处理细胞后，PTEN干扰组中Cyclin
B1蛋白表达与未处理组相比明显增加。结论:在He
La细胞中干扰PTEN表达会导致细胞周期阻滞于G2/M期，这可能与细胞周期相关蛋白Cyclin
B1表达水平降低有关。
刘丽萍等人探讨了茶黄素对人宫颈癌细胞株HeLa顺铂敏感性的影响，并探讨其相关机制。
方法：(1)取对数生长期HeLa细胞接种于96孔板，设观察1~9组和对照1~9组，每组3个复孔。对照1~9组细胞分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50μg/mL顺铂，继续培养24
h。观察1~9组先加入10μg/mL的茶黄素，再分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50μg/mL顺铂，继续培养24
h。采用MTT法检测各组OD490，计算各组细胞存活率，然后计算顺铂对观察组和对照组HeLa细胞的半数抑制浓度(IC50)。
(2)取对数生长期HeLa细胞接种于96孔板。设对照组、顺铂组、茶黄素组和联合组，每组3个复孔。对照组细胞不加药，顺铂组加入10μg/mL的顺铂，茶黄素组加入10μg/mL的茶黄素，联合组加入10μg/mL的顺铂和10μg/mL茶黄素，继续培养24
h后，采用Western blotting法检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase
9、PARP和NF-κB信号通路相关蛋白p-IκBα、p-NF-κB和pAkt。
结果：(1)对照1~9组HeLa细胞存活率分别为102.54%±4.21%、98.32%±2.46%、96.11%±3.64%、90.36%±3.91%、86.29%±3.17%、81.46%±3.61%、78.92%±4.18%、70.63%±4.25%、63.28%±4.21%，顺铂对HeLa细胞的IC50为25μg/mL。观察1~9组HeLa细胞存活率分别为102.54%±4.21%、80.21%±3.82%、78.92%±4.24%、77.93%±3.95%、68.26%±3.24%、50.36%±4.29%、45.32%±4.74%、40.25%±3.21%、35.37%±3.16%，顺铂对HeLa细胞的IC50为10μg/mL。
(2)顺铂组、茶黄素组、联合组细胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase
9、PARP相对表达量均高于对照组(P均<0.05)，联合组细胞Cleaved Caspase 3、Cleaved
Caspase
9、PARP相对表达量均高于顺铂组、茶黄素组(P均<0.05)。顺铂组、对照组细胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相对表达量相比P>0.05，茶黄素组细胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相对表达量高于对照组(P均<0.05)，联合组细胞pIκBα、p-NF-κB和p-Akt相对表达量高于顺铂组和茶黄素组(P均<0.05)。结论茶黄素能够增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，其机制可能与增加凋亡相关蛋白Cleaved
Caspase 3、Cleaved Caspase
9、PARP表达及抑制NF-κB信号通路相关蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表达有关。
