一、背景
人急性T淋巴细胞白血病细胞该细胞源自一位14岁患有T淋巴细胞白血病男性的外周血。
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵及骨髓外的组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝等。我国曾进行过白血病发病情况调查，ALL发病率约为0.67/10万。在油田、污染区发病率明显高于全国发病率。ALL儿童期（0～9岁
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一、背景
人急性T淋巴细胞白血病细胞该细胞源自一位14岁患有T淋巴细胞白血病男性的外周血。
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵及骨髓外的组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝等。我国曾进行过白血病发病情况调查，ALL发病率约为0.67/10万。在油田、污染区发病率明显高于全国发病率。ALL儿童期（0～9岁
）为发病高峰，可占儿童白血病的70%以上。ALL在成人中占成人白血病的20%左右。依据ALL不同的生物学特性制定相应的治疗方案已取得较好疗效，大约80%的儿童和30%的成人能够获得长期无病生存，并且有治愈的可能。
二、人急性T淋巴细胞白血病细胞培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入细胞库推荐的无血清冻存液。
三、应用
人急性T淋巴细胞白血病细胞可以用于FTO促急性T淋巴细胞白血病细胞生长的研究：
N6甲基腺苷(m6A)修饰是mRNA内部丰度最高的修饰,其动态修饰过程和生物学功能由甲基转移酶(writer)、去甲基酶(eraser)和识别蛋白(reader)共同调控。FTO(Fat mass and obesity-associated protein)是m6A修饰的主要去甲基酶,具有促进肿瘤发生发展的功能,且已有多种研发成功的小分子抑制剂。然而,FTO在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中的表达、功能及作用机制尚无文献报道。本论文旨在研究FTO在T-ALL细胞中的表达和功能、解析FTO的作用机制,并评价FTO小分子抑制剂的抗T-ALL效能。
方法：
(1)通过RT-qPCR检测FTO在T-ALL细胞与正常对照细胞中的表达;在T-ALL细胞中沉默和过表达FTO,并检测细胞的m6A修饰水平、生长和集落生成等;检测沉默FTO对细胞凋亡及Jurkat细胞在免疫缺陷(NSG)小鼠中诱发白血病的能力;检测沉默FTO对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。
(2)RNA-seq筛选T-ALL细胞中受FTO表达影响的差异表达基因,并使用RT-qPCR验证;通过放线菌素D(ActD)和RNA甲基化免疫共沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)等实验筛选FTO的下游靶基因;在单独沉默RAB7A(RAS-related GTP-binding proteins)后,检测细胞生长、集落生成和细胞凋亡等;在沉默FTO细胞中过表达RAB7A,通过RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecitation,RIP)研究YTHDF2(YTH domain family 2,m6A识别蛋白)与RAB7A mRNA之间的相互作用;使用精胺普鲁兰递送的方法,在沉默FTO的细胞中沉默YTHDF2,检测细胞的生长、集落生成和RAB7A表达等。
(3)检测FTO的抑制剂(FB23-2)对T-ALL细胞的活性、集落生成、细胞凋亡和白血病生成能力的影响;并检测FB23-2对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。
结果：
(1)FTO在T-ALL细胞较正常造血细胞中异常高表达;FTO调控T-ALL细胞的m6A修饰水平,FTO促进T-ALL细胞的体外生长及集落生成能力;沉默FTO促进细胞凋亡、显著减弱Jurkat细胞在NSG小鼠中的成白血病能力；
(2)RNA-seq和验证显示FTO在转录后水平调控RAB7A的表达,沉默FTO增强RAB7A mRNA上的m6A修饰;沉默RAB7A显著抑制T-ALL细胞的生长和集落生成能力,并诱发细胞凋亡;过表达RAB7A能部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制和凋亡增高;YTHDF2能在沉默FTO细胞中较对照细胞更强地结合RAB7A mRNA,沉默YTHDF2部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制与RAB7A表达受抑。
(3)FB23-2有效抑制T-ALL细胞的活性,集落生成能力,并诱发凋亡,但对正常造血细胞影响较小;FB23-2也显著减弱Jurkat细胞的白血病生成能力。结论:FTO在T-ALL细胞中异常高表达,通过抑制RAB7A的m6A/YTHDF2依赖性降解而稳定其表达;FTO/m6A/RAB7A通路促进T-ALL细胞的生长与生存;FTO的小分子抑制剂具有一定的抗T-ALL效能。
二、人急性T淋巴细胞白血病细胞培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入细胞库推荐的无血清冻存液。
三、应用
人急性T淋巴细胞白血病细胞可以用于FTO促急性T淋巴细胞白血病细胞生长的研究：
N6甲基腺苷(m6A)修饰是mRNA内部丰度最高的修饰,其动态修饰过程和生物学功能由甲基转移酶(writer)、去甲基酶(eraser)和识别蛋白(reader)共同调控。FTO(Fat mass and obesity-associated protein)是m6A修饰的主要去甲基酶,具有促进肿瘤发生发展的功能,且已有多种研发成功的小分子抑制剂。然而,FTO在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中的表达、功能及作用机制尚无文献报道。本论文旨在研究FTO在T-ALL细胞中的表达和功能、解析FTO的作用机制,并评价FTO小分子抑制剂的抗T-ALL效能。
方法：
(1)通过RT-qPCR检测FTO在T-ALL细胞与正常对照细胞中的表达;在T-ALL细胞中沉默和过表达FTO,并检测细胞的m6A修饰水平、生长和集落生成等;检测沉默FTO对细胞凋亡及Jurkat细胞在免疫缺陷(NSG)小鼠中诱发白血病的能力;检测沉默FTO对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。
(2)RNA-seq筛选T-ALL细胞中受FTO表达影响的差异表达基因,并使用RT-qPCR验证;通过放线菌素D(ActD)和RNA甲基化免疫共沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)等实验筛选FTO的下游靶基因;在单独沉默RAB7A(RAS-related GTP-binding proteins)后,检测细胞生长、集落生成和细胞凋亡等;在沉默FTO细胞中过表达RAB7A,通过RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecitation,RIP)研究YTHDF2(YTH domain family 2,m6A识别蛋白)与RAB7A mRNA之间的相互作用;使用精胺普鲁兰递送的方法,在沉默FTO的细胞中沉默YTHDF2,检测细胞的生长、集落生成和RAB7A表达等。
(3)检测FTO的抑制剂(FB23-2)对T-ALL细胞的活性、集落生成、细胞凋亡和白血病生成能力的影响;并检测FB23-2对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。
结果：
(1)FTO在T-ALL细胞较正常造血细胞中异常高表达;FTO调控T-ALL细胞的m6A修饰水平,FTO促进T-ALL细胞的体外生长及集落生成能力;沉默FTO促进细胞凋亡、显著减弱Jurkat细胞在NSG小鼠中的成白血病能力；
(2)RNA-seq和验证显示FTO在转录后水平调控RAB7A的表达,沉默FTO增强RAB7A mRNA上的m6A修饰;沉默RAB7A显著抑制T-ALL细胞的生长和集落生成能力,并诱发细胞凋亡;过表达RAB7A能部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制和凋亡增高;YTHDF2能在沉默FTO细胞中较对照细胞更强地结合RAB7A mRNA,沉默YTHDF2部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制与RAB7A表达受抑。
(3)FB23-2有效抑制T-ALL细胞的活性,集落生成能力,并诱发凋亡,但对正常造血细胞影响较小;FB23-2也显著减弱Jurkat细胞的白血病生成能力。结论:FTO在T-ALL细胞中异常高表达,通过抑制RAB7A的m6A/YTHDF2依赖性降解而稳定其表达;FTO/m6A/RAB7A通路促进T-ALL细胞的生长与生存;FTO的小分子抑制剂具有一定的抗T-ALL效能。