多重PCR引物设计示范
2011-06-20 03:29阅读：
有同行使用iCubate2.0以后不知到下一步如何做，这里试图介绍一下我们的经验。
iCubate2.0现阶段的一个局限就是没有做Sequence Alignment,
不能帮助找到靶基因的保守区。这个功能以后会加进去的，现在可以通过程序外面的一些运作来解决。下面的例子是假设我们要给一个大肠杆菌毒素基因设计引物。步骤如下：
（1）google找到相关论文。 用关键词“PCR, E coli' 来google, 就会得到如下结果，选择一篇论文。
（2）从论文中得到靶基因的信息。把靶基因片段的信息拷贝出来，再去GenBank做“钓鱼”找到靶基因的完整信息。
（3） 到了NCBI网站后选择Blast.
(4) 再选nucleotide blast.
(5)
然后把前面论文中找到的靶基因片段贴到序列框中。注意选择非人类数据库做比较。然后按Blast。这个动作的目的是通过一个引物或者探针的短序列，得到特异性靶基因的长序列。
（6）得到许多同源基因序列后选择一个比较全面的文献打开。把完整的靶基因拷贝出来，再用这个序列做下一轮的Blast,
目的是做同源基因的列比，找到保守区来设计成功率高的引物。
（7）把完整的靶基因放到序列框做Blast. 注意Blast的时候的格式，这样结果比较容易看。
（8）寻找靶基因的保守区。Blast的结果是同源基因比列（Alignment).
用上面的格式，相同的碱基用点表示，不相同的被标记出来。把这个文献打印出来，便于下一步的引物设计。
（9）接下来，到iCubate2.0网站，进入iC-Architect进行利用PPI和arm-PCR原理来设计引物。
给试剂（iC)命名，给靶基因命名。
把从NCBI得到的完整的靶基因序列放入iC-Architect的序列框里，按Submit键得到结果。
不过这样设计出来的引物因为没有做同源基因的列比，不能保证是在保守区里面。
所以请到结果的底部，下载这个PPI和序列的文献：
(10) 用Excel完成引物设计。先把下载的Excel
文献做些格式上的调整。注意第一列是核酸的位置，地二列是核酸序列，第三和第四列分别是与正向和反向序列对应的PPI值。
为了方便观察，把反向的PPI值变成负值。一个简单的办法就是用-1 paste multiply 给所有反向PPI值。
然后把所有比较大的正向PPI值挑出来：具体方法就是选择Conditional
Formatting。比如把所有正向PPI值选上，然后用Conditional
formatting的指令把所有那些大于100的用红色标记，然后把所有小于-100的用蓝色标记：
（11）
找到合适的引物，然后看是否在保守区里面（参照第8步）。比如下图中正向外面的引物的序列就是5'CGGTATCCTATTCCCGGGAA3',
从第53位碱基开始，到72位结束。这个引物的三撇端的几个碱基相关的PPI值都很高，所以是多聚酶比较喜欢的起始位点。下图还标记出Forward
in primer的位置，77－96。探针可以从100－120，反向引物可以从157-138,
注意三撇段也是具有比较高的PPI值。
我们正在改进iC-Architect，使得这些靶基因选择，保守区选择等功能都被预先考虑在内，用软件自动解决。不过为了能快速把现有的技术推广出去，我
们就先把第一版软件先推出了。这些靶基因选择，保守区选择的“雕虫小技”起始也是学习分子生物学的必修课，大家本来就应该掌握的。如果所有技巧都用软件自
动化了，还要我们这些硕士，博士干什么？
不过，话是这么说，软件上的不足我们是知道的，也正在做修改和完善。现在的
iC-Architect的主要功能是把PPI和arm-PCR的一些设计原理固化了。这样设计出的引物就可以先用起来了，看看是否能做多重。下一步就是
和iCubate卡盒结合，利用仪器做全自动的测试了。
