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蛋白纯化及经验总结

2018-11-26 14:24阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5023365736

一、分离纯化蛋白质的一般程序
 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：
 （一）材料的预处理及细胞破碎
 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
蛋白纯化及经验总结
(二）蛋白质粗制品的获得
 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
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（三）样品的进一步分离纯化
 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
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二、蛋白纯化过程中的注意事项
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。
2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL~mg/mL。
3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。
4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。
5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。
6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。
7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇)，防止蛋白质的氧化。
8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。
9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。


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