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DNA核酸浓度的测定实验

2022-07-08 14:18阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5023365736

关键词：DNA核酸浓度 科进 Kirgen 爱思进 Axygen 康宁 corning 耐思 NEST 白鲨易 biosharp

实验方法原理
寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA可以定量溶于缓冲液，构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为260nm。窄光带紫外分光光度计，长260nm．，比色杯光径1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/m1单螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。


实验材料
样本DNA

试剂、试剂盒
双蒸水

仪器、耗材
紫外分光光度计 比色杯

实验步骤
1. 取DNA溶液10ul，加双蒸馏水600ul（即稀释61倍）。
2. 用双蒸馏水调零，测定260nm和280nm的吸光度值（A260. A280）．
3. DNA浓度（ug／ul）＝A260x 50x 61／1000
4. DNA纯度：A260/ A280的比值应大于1.7以上，若样品中含有蛋白质（吸收峰在280nm）等杂质时，比值下降，应重新纯化．

注意事项
在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳
定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

其他
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

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