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流式细胞分析中的荧光素你选择对了吗?

2019-04-08 10:56阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5226225459

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。当前，流式细胞分析已成为科研发展的一个热点，它应用广泛，主要用于：
1.测定细胞内 DNA 的变异系数
2.DNA 倍体分析
3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究
4.快速进行细胞分选和细胞收集
5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代 谢
动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究
6.应用于外周血内皮细胞测定、调节性 T 细胞等尖端领域
流式技术借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究，正是科研中所
应用的重要技术之一。而荧光素则首当其冲成为科研人员荧光标记研究的选择。
常用的荧光素及其特性
1.藻红蛋白（PE）
R-PE/B-PE：是用于生物学检测的超灵敏荧光染料。它们比传统的有机荧光团灵敏 度高 100 倍。其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪；PE的最大发射波长为 575nm，在流式细胞仪的 FL2 通道检测。
产品货号 Cat#2556

2.PE-TexasRed
PE-Texas Red 是流式细胞仪中常用的的试剂。是由 PE 和 TexasRed（TR）组合而成
的 Tandem 荧光素。其主要吸收峰位于 565nm，发射峰位于 600nm。其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪；PE-TR 的最大发射波长为615nm，在流式细胞仪的 FL3 通道检测。
产品货号 Cat#2619

3.碘化丙啶（PI）
碘化丙啶（PI）属于与溴化乙锭相同的化学类别。与溴化乙锭的情况一样，其与荧
光结合后的荧光增强 20-30 倍。荧光激发最大值红移 30-40nm，荧光发射最大蓝移
15nm 左右。PI 还与 RNA 结合为 DAPI 和吖.啶橙。PI 通常用于鉴定细胞群中的死细 胞并用作多色荧光技术中的复染剂。它还可用于区分坏死细胞，凋亡细胞和正常细胞。其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪；PI 的最大 发射波长为 617nm。在流式细胞仪的 FL3 通道检测。
产品货号 Cat#17517

4.PE-Cy5
PE-Cy5 是流式细胞术中常用的试剂，是由 PE 和 Cy5 组合而成的 Tandem 荧光素。 其主要吸收峰位于 565nm，发射峰位于 666nm。 对于这种试剂，建议使用 682/33nm 和 695/40 nm 的滤光片组。其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器 的流式细胞仪；PE-Cy5 的最大发射波长为 670nm，在流式细胞仪上用 FL3 通道检测。 产品货号 Cat#2610

5.紫草素叶绿素（PerCP）
从藻类植物中分离，它具有极高的消光系数，高量子效率和大的斯托克斯位移。氩
激光器在 488 nm 处激发，其最大发射峰在 677nm 处,所以它在流式细胞仪的 FL3 通 道 检 测。 PerCP 蛋白通常用于荧光免疫标记，特别是涉及荧光激活细胞分选（FACS）的应用。 产品货号 Cat#2559

6.别藻蓝蛋白（APC）
别藻蓝蛋白（APC）是从螺旋藻（一种蓝绿藻）中分离的藻胆蛋白。与其他藻胆蛋 白一样，APC 是荧光的，具有极高的吸收率和高量子效率。它是一种蛋白质，通过常规蛋白质交联技术可以很容易地与抗体和其他蛋白质连接，而不会改变其光谱特 征。其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为 633nm 的多色流式细胞仪；APC 最大发射波长为 660nm，在流式细胞仪中只有配有双激光器的 FL4 才能检测。产品货号 Cat#2554

7.APC-Cy7
APC-Cy7 是流式细胞仪中常用的试剂。其主要吸收峰位于 651nm，发射峰位于 ~780nm。是由 APC 和 Cy7 组合而成的 Tandem 荧光素；其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为 633nm 的多色流式细胞仪，APC-Cy7 主要用于四色以上的流式细胞术。 产品货号 Cat#2625
荧光素荧光强度比较

1. 荧光强度与染色指数有关
染色指数：SI（Stain Index）=D/W，染色指数越高，荧光强度越好，反之亦反。原理：如果另一个荧光素阳性细胞群的平均荧光强度（MFI）更低，那么 SI 也会降 低。即，随着阳性群的左移，SI 也会降低；如果另一个荧光素产生的阳性细胞群MFI 一样，但是阴性群的基底更宽，即意味着变异系数更大（即使阴性细胞群的 MFI 也是一样的），那么其 SI 也会降低。即，随着阴性群 SD 增大，SI 降低。
2.荧光强度的其他影响因素
不同的荧光素亮度还会受到以下因素的影响，例如：
1. 抗体克隆和抗体质量
2. 荧光素纯度和质量
3. 荧光素和蛋白比例（f:p 比例）
4. 激光和激光器功率
5. 使用的长通和带通滤光片
6. 使用的目的细胞
因此，我们对于不同公司、不同克隆的抗体，即使用了同样的荧光素，也要用SI 进行重新评估，而不是根据现成的排行榜单，因为影响因素很多。根据 SI 计 算，本公司相关产品的荧光强度排名如下：PE>APC>FITC>PerCP
附双色流式细胞仪荧光素的通道选择

多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

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