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1.细胞复苏
细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：
1）预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基
2）从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀
3）当冻存管内完全融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中
4）离心5min，去除上清，得到沉淀
5）用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规培养
细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。
2.瞬时转染
以Lipofectamine转染试剂为例的操作流程，不同转染试剂参考说明书
1）将复苏后常规培养的细胞按照1-3x10^5接种到6孔板中，加入2-4ml的完全培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜
2）无菌状态下配置如下溶液：a
b
3）将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右
4）细胞培养至80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1ml的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时
5）将转染液倒出，换为完全培养基继续培养
3.稳定细胞系筛选
24-72h加入选择性抗生素进行稳转细胞系建立，预实验确定抗生素的最佳浓度，确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度。
1）提前一天接种细胞与24孔板中，待第二天长成25%单层为宜，二氧化碳培养箱中37℃过夜培养。
2）第二天将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。
3）培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准，一般为400-800ug/ml，筛选细胞时刻适当提高浓度
4）二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代，使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆，有限稀释法挑取单克隆。
5）Western
最终筛选出稳定高表达目的基因的细胞株，相对于瞬时转染稳转株筛选节约大量的时间和成本，是满足活性蛋白大量制备的最好方法。