紫外可见光谱法研究脂质体结构形态与染料的相互作用
2015-02-03 15:34阅读：
脂质体又称类脂泡囊，是当前一个十分活跃的研究领域，在生物科学、药物载体、基因工程、化妆品和食品工业等多个领域得到广泛应用。脂质体的物理、化学性质以及它的生物学性质主要是由
类脂的组成、制备技术、粒子的大小分布和脂质体的层数决定。同一种类脂分子，在不同的制备条件下也会形成胶束、层状相、反六方相等不同的形态，而通常由于脂质体的粒径特别小，要用扫描隧道显微镜、核磁共振、光散射、X-
射线衍射、冰冻-刻蚀技术等复杂手段来检测。
本文选取了脂质体的三种特定结构：胶束，层状相，反六方相作为研究对象，通过研究多种染料与脂质体可能出现的典型结构相态相互作用，从而产生不同的现象，利用可见光谱的变化来检验制备过程中脂质体的形态。初步探索了用染料法检测脂质体结构相态的方法，有望作为一种简便快捷的检测手段，用于分离天然磷脂及生产过程中控制脂质体形状结构。
药品与仪器
DMPC（二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱），纯度为99.6%，D
MPE（二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺），纯度为99.8%。756CRT紫外-可见分光光度计（上海分析仪器总厂），透射电子显微镜（HITACHI，H-600），真空旋转蒸发仪（上海医械专机厂，ZFG85A），pH计（ORION，SA-720）。
实验步骤
（1）胶束状脂质体的制备；
（2）层状脂质体的制备；
（3）反六方相脂质体的制备；
（4）染料的配制；
（5）将制得的脂质体用磷钼酸盐负染，涂在铜网上，放入真空干燥器中蒸干多余水分，在电子显微镜下观察。
（6）将不同的染料1滴，（大约为0.02mL）分别加入到H2O，SDS，DMPC，DMPE
的溶液中，用756CRT型分光光度计测其吸收峰的位置。
结果与讨论
各种脂质体与染料作用的吸收光谱，由SDS制备成的脂质体呈胶束状态。我们观察到，制成的脂质体经一天一夜水合后，向其中滴加染料，在可见光下观察其颜色。DCPIP可区分胶束与层状及反六方相。，与在水溶液中的吸收光谱相比，DCPIP在SDS中，280~350nm之间没有吸收峰，在DMPC和SDS中都在520~550nm范围内出现吸收峰，溶液为粉色，相对于DCPIP在H2O溶液中605nm处的吸收峰发生蓝移，这说明用DCPIP还可以区分制备10天之后的DMPC和DMPE所形成的层状和反六方相脂质体。
不同结构的脂质体与染料作用的机理探讨，类脂分子所形成的结构，主要由类脂分子和水的含量决定。许多磷脂，在足量的水中形成层状相，而当水的含量降低时，会形成反六方相或反立方相。用蒸馏水制备的各种相态的脂质体，经过一段时间后，会使DCPIP和刚果红产生不同的颜色变化。这是因为，组成脂质体的模材DMPC和DMPE是具有活性的类脂，当类脂薄膜溶解在水中时，它们在水中会发生水解，产生自由脂肪酸，破坏了脂质体的结构，从而使体系的pH值降低并形成了新的混合胶束。形成的胶束与染料相互作用而使其颜色发生变化。我们利用层状相和反六方相脂质体发生颜色变化的速度不同这一特点，可以将由缓冲液制成的脂质体取出一部分，约5mL，滴加稀盐酸，破坏缓冲系统，然后升高温度（在80℃），3~5min后，利用上面所述的特征颜色变化来判断制备的脂质体是层状相还是反六方相，即若是层状相，水解较快，当它被破坏后，使DCPI
P变粉色、刚果红变蓝或蓝粉，而反六方相的脂质体，水解慢，当层状相被破坏使染料变色时，它还不能使DCPIP和刚果红变色。
结论
1.用缓冲溶液制备的脂质体，制备后，马上加入染料，若形成的脂质体为胶束，则会使DCPIP水溶液由蓝色变为粉色，使刚果红由红色变为蓝色或蓝粉色，利用紫外-可见分光光度计可观察到氯化频哪吲哚在550nm
处左右的吸收峰红移；而层状相和反六方相的脂质体不会马上与染料产生颜色变化。因此，可区分出胶束状脂质体。
2.若用二次蒸馏水制备脂质体，制备后取出5mL，在80℃加热3~5min
，使之水解，若滴加DCPI
P，颜色变粉，滴加刚果红变蓝或蓝粉；利用分光光度计可观察到钙黄绿素的吸收峰发生蓝移，并有肩峰出现，还可使KI／I2在296和366nm的峰显现出来，则脂质体为层状相。若颜色不发生变化，或未使钙黄绿素的吸收峰出现变化，则脂质体为反六方相。
3.若用缓冲液制备脂质体，制备后滴加适量的酸，破坏缓冲体系，利用2）中的现象来区分脂质体的层状相和反六方相，更加直观的变色染料是DCPIP和刚果红，可用眼睛直接观察到颜色变化。
