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[转载]PCR反应条件的优化——循环参数（反应温度与时间）

2016-02-19 12:31阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5329311910

原文地址：PCR反应条件的优化——循环参数（反应温度与时间）
原文作者：墨土

特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。但影响因为颇多，遗憾的是，高特异的反应条件可能与高产量的反应条件并不一致。同样高保真也可能会导致地产率。因此，建立PCR反应时，必须清楚哪一个参数对预期的扩增是最重要的，据此优化反应条件。循环参数是主要因素之一。

在标准反应中，将模板DNA加热至90～95℃，使双链DNA变性，再快速冷却至40～60℃使引物退火并结合到互补靶序列上，然后升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。每一步的时间从反应达到要求的温度后计算。

1.
变性
PCR反应开始后，首先使双链模板DNA解链为单链，95℃变性20～30秒即可使一般的DNA分子完全变性，变性温度过高或变性时间过长都会导致DNA聚合酶活性的下降，从而影响PCR的产量。但若变性温度过低会导致DNA模板变性不完全，则引物无法与模板结合，亦会导致PCR反应的失败。对于富含G、C的模板应适当提高变性温度。

2. 退火
引物与模板的退火温度由引物的长度及GC含量决定，引物长度为1525bp时，其退火温度可由Tm值确定，Tm=4（G+C）2（A+T），退火温度T=Tm-5。提高退火温度可减少引物与模板之间的费特异性结合，提高PCR反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。退火时间一般为20～40秒，时间过短会导致延伸不充分，后面延伸步骤时温度升高，会导致引物从模板脱落，PCR反应失败。如待扩增目的DNA片段含量很少，可在PCR前几次循环中适当延长退火时间，这样有利于引物与模板的结合，提高PCR反应的灵敏度。

3. 延伸
延伸温度取决于所用的DNA聚合酶的最适温度，一般为70～75℃。延伸时间由扩增片段的长度决定，扩增小于500bp的DNA片段的延伸时间为20s，扩增500～1200bp的DNA片段的延伸时间为40s，扩增片段大于1kb，则需增加延伸时间（Taq聚合酶的聚合速率约为1000～2000bp/min）。当扩展片段小于150bp时，则可省略延伸步骤，因为退火温度下，TaqDNA聚合酶的或许已足以完成短序列的合成。

4. 循环次数
PCR的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25～35次，此时PCR产物的记录即可达最大值，刚刚进入“平台期”。即使再增加循环数，PCR产物量也不会再有明显的增加。“平台期”是指PCR后期循环产物的对数积累趋于饱和，并伴随0.3～1pmol序列的累积。随着循环次数的增加，一方面犹豫产物浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率的降低；另一方面，随着循环次数的增加，TaqDNA聚合酶活性下降，引物及dNTP浓度下降，易发生错误掺入，费特异性产物增加。因此，在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。

5. 两步PCR
对于相对较短的DNA片段（100～200bp），可将退火、延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步PCR（94℃变性1min，65～68℃退火延伸1min）能产生与三步PCR同样多的产物。这可能是由于反应混合物在变性温度和退火温度（94～50℃）之间过渡时，已达到了Taq聚合酶的最佳反应温度（70～75℃），在这么短的时间内与模板退火结合的引物已经充分延伸形成产物片段。这样既保证引物与模板结合的特异性，又可使引物顺利延伸。与标准PCR相比，二温式两步PCR操作更简便、快速，特别适于临床检验。

参考文献：张维铭—《现代分子生物学实验手册》。

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