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细胞毒性测试MTT法

2018-05-23 17:30阅读:
本测试是遵照ISO 10993-5:2009医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》,检测M-1275(1165U2-14)的潜在细胞毒性。将测试样品、阴性对照品、阳性对照品置于无血清MEM培养基里37浸提24小时。然后把样品浸提液稀释成一定的浓度(100%50%25%12.5%)。L929成纤维单层细胞养成后,吸出原来的培养液,分别给以不同浓度的浸提液和稀释液,在375%二氧化碳培养箱中培养24-26小时。然后去除培养基,加入MTT3-(45-二甲基噻唑-2)-25-二苯基四氮唑溴盐)溶液,继续培养2小时。最后移去MTT溶液,加入异丙醇进行溶解。测
试样品的细胞活力根据与空白对照比较得到。活细胞减少会导致测试样品中代谢活动减少。这减少又直接与蓝紫色结晶甲臜形成相关,这一变化能在570nm波长处测定其吸光度的改变。
测试样品进行三个平行重复试验。
实验过程中,100%浓度的测试样品浸提液的细胞活性小于70%,测试样品浸提液对L929小鼠成纤维细胞有细胞毒性的倾向性

L- 929小鼠成纤维细胞(ECACCCAT# 85103115,或等效源)组成的哺乳动物单层细胞作为测试系统。体外哺乳动物细胞培养以及利用体外哺乳细胞进行生物材料和医疗器械细胞毒性评价的研究已经有相当长的历史

L-929细胞培养在含10%胎牛血清和抗生素(青霉素100U/mL,链霉素100ug/mL)的MEM培养液中,置于375% CO2培养箱中培养,在测试中,标记细胞代数和日期。培养获得的单层融合细胞为测试所使用。根据STC批准的SOP,整个细胞培养试验过程使用无菌操作技术。



MTT法是一种显色细胞毒性测试方法。它定量测量了细胞接受浸提液或溶液后的细胞活力和细胞增殖情况。代谢活跃的细胞通过活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶的作用,将黄色四唑盐MTT3-(45-二甲基噻唑-2)-25-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。黄色到紫色的变化可以通过光谱光度测量进行定量分析。
吸光度值低于空白对照细胞表明了细胞活性的降低,而相反吸光度值变高则表明了细胞活性的增加。
样品中活细胞数量的减少也引起了细胞代谢活动的减少。这个减少直接与蓝紫色甲瓒结晶形成相关,并被570nm吸光度检测到。
细胞活力百分比就是样品测量值与对照细胞的比值,根据下列公式进行计算:
细胞活力百分比 =
100 x OD570e
OD570rc
OD570e 是空白孔修正后的测试样品或对照的吸光度均值。
OD
570rc 是空白孔修正后的空白对照的吸光度均值。
更多细节可以联络标检杨工:13925725236 QQ:904895004

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