高拷贝BAC载体-pCUGIBAC1

2016-03-21 22:32阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5822812898

利用大肠杆菌F因子改造得来的BAC载体系统，由于能够严格的控制质粒的拷贝数，避免了外源片段的嵌合、缺失和重排效应，在基因组研究发挥了巨大的作用。但作为一种常规使用的工程载体，在大肠杆菌细胞中始终维持低拷贝，不利于基因克隆过程中载体的制备和外源DNA的大量扩增。
2002年Wild等尝试过用传统的方法增加BAC载体的复制能力，在载体中添加L-阿拉伯糖诱导的高拷贝复制子oriV，宿主菌基因组中插入一个由araC-paraBAD启动子诱导编码的TrfA复制蛋白的基因。虽然在相应的宿主菌内复制子oriV能提高BAC载体的拷贝数，但操作条件复杂，特定的菌株（含araC-paraBAD启动子的突变菌株）也很难得到，大大限制了该载体的使用范围。
pCUGIBAC1 载体
早在2001年，我公司董事长罗美中教授为方便BAC载体制备、提高文库构建的效率，将单拷贝BAC载体pIndigoBAC536和高拷贝的pGEM-4Z连接，获得高拷贝载体pCUGIBAC1（

pCUGIBAC1=pIndigoBAC536-S::pGEM-4Z）。单拷贝的pIndigoBAC536可以很方便地从高拷贝的pCUGIBAC1载体回收获得，并保持了原有的所有特征。由于高拷贝的pCUGIBAC1载体重组了lacZ基因，保持了载体的完成性。因而在构建BAC文库时，通过蓝白斑筛选，不含外源DNA的空载体克隆和含外源DNA的重组克隆可以很容易区分开来，不会发生空载体污染。
pCUGIBAC1的质粒图谱

高拷贝BAC载体-pCUGIBAC1

pCUGIBAC1载体的质粒
BAC载体pIndigoBAC536和多功能质粒载体pGEM-4Z是通过包含EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ三个限制性内切酶位点的片段连接起来的。载体制备时，可以选择三个限制性内切酶中的任意一个进行完全酶切，释放载体中的pGEM-4Z载体片段，制备得到高纯度的单拷贝pIndigoBAC536载体。
1、pCUGIBAC1 载体拥有氯霉素和氨苄青霉素素两种抗性基因。
2、载体含有两个Sp6和T7转录起始位点。
3、pGEM-4Z是一类多功能质粒载体，高拷贝。
4、pIndigoBAC536载体是BAC文库构建的常用载体，具有蓝白斑筛选效应，插入片段大（>110kb)。
pIndigoBAC536的质粒图谱

高拷贝BAC载体-pCUGIBAC1

pIndigoBAC536的质粒图谱
pIndigoBAC-536来源于pIndigoBAC-5载体，在原有载体的LacZ基因的3'端引入一个定点突变位点，进行蓝白斑筛选时篮斑颜色更深，有利于重组克隆的挑选。pCUGIBAC1=pIndigoBAC535::pGEM-4Z。
参考文献：Luo Meizhong, Wing Rod A: An Improved Method forPlant BAC Library Construction. Methods in Molecular Biology 2003, 236:3-20.
原文链接：武汉拜科基因科技有限公司

举报/Report

我的更多文章

下载客户端阅读体验更佳