测食用油中三种辣椒素的含量

2016-09-28 17:11阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/5935979595

摘要：以动植物油脂为实验材料，建立了测定食用油中天然辣椒素、 二氢辣椒素和合成辣椒素含量的凝胶渗透色谱 – 高效液相色谱–串联质谱 (GPC–HPLC–MS／MS) 法。样品经凝胶渗透色谱净化后，采用液相色谱串联质谱法 (HPLC–ESI–MS／MS) 分析，多反应监测模式（MRM）下外标法定量。在 0.1～5.0 μg／L 范围内线性良好，天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的相关系数分别为 0.999 6，0.999 8， 0.999 8，检出限为 0.5 μg／kg。在 5 μg／kg 添加水平下，空白加标回收率为 71.5%～82.5%，测定结果的相对标准偏差为3.0%～8.3%(n=6)。该方法样品处理过程简便快捷，测定结果准确，可满足实验室大量、快速分析的需求。
Abstract：A new method for the determination of capsaicin, dihydrocapsaicin and nonivamide in edible oil by using GPC–HPLC–ESI–MS／MS was developed. The samples were cleaned up by GPC and then determined by LC–ESI– MS／MS With multiple reaction monitoring(MRM). The calibration c

urves were linear in the range of 0.1–5.0 μg／L with the corelation coefficient of 0.999 6， 0.999 8， 0.999 8 for capsaicin, dihydrocapsaicin and nonivamide. The quantitation limit was 0.5 μg／kg. The recoveries were in the range of 71.5%–82.5%, and the relative standard deviations of which were 3.0%–8.3%(n=6). The method has the advantages of simple pretreatment and acccurate determination results, which can meet the requirement of rapid analysis in a large number of samples.
油脂是人们日用食品，近年来，在暴利的驱使下，不法商贩将非食用油脂直接销售或添加到正常的食用油中销售，这些产品中含有大量有毒有害成分，长期食用对人体健康会造成巨大伤害。目前，我们国家还没有相关标准检测食用油中是否添加了劣质油脂。
食用油中违法添加的劣质油脂多为重复使用后的餐厨废油，其中餐饮业的泔水油是劣质油脂的主要原料。辣椒是餐饮食品中的常用佐料，使用范围很广。辣椒中辣椒碱的主要成分为天然辣椒素和二氢辣椒素，占总辣椒碱 90% 以上。合成辣椒素是人工合成的具有类似天然辣椒素生物学功能的化合物，它的分子结构不同于天然辣椒素。与天然辣椒素相比，合成辣椒素在价格和辣度方面有绝对优势，因此存在被非法使用的可能。正常情况下食用油生产过程中不接触辣椒，成品食用油中不会含有辣椒素。而目前劣质食用油的加工工艺尚难以将这些脂溶性的辣椒碱类物质完全清除干净，因此如果食用油样品中检测出大量的辣椒碱类物质，这些样品就是问题样品，需要进一步具体分析。通过监测辣椒素含量可以为监管部门提供技术支持。
辣椒素的检验方法有液相色谱法、液相色谱 – 质谱法等；凝胶渗透色谱对油脂类物质的净化效果好，而且凝胶渗透色谱仪器自动化程度高，操作方便，目前还没有使用凝胶渗透色谱法处理油脂样品的报道。笔者利用凝胶渗透色谱 – 液相色谱 –串联色谱法测定食用油中天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素含量，方法快捷，测量精密度、准确度满足分析要求。
1. 实验部分
1.1主要仪器与试剂
液相色谱 – 串联质谱仪： Waters-TQS 型，美国Waters 公司；
去离子水发生器： Milli-Q 型，美国 Millipore 公司；
凝胶渗透色谱仪： Freestyle 型，德国 LC–TECH公司；
甲醇、甲酸、乙酸乙酯、环己烷：色谱纯，美国Tedia 试剂公司；
微孔滤膜：孔径为 0.22 μm ；
天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素标准品：纯度大于 99%，德国 Dr. Ehrensorfer 公司；
辣椒素标准储备液： 1 mg／mL，分别精确称取天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素 10 mg 于 10mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于 –20℃冰箱中保存。根据实际需要用色谱流动相将标准储备液稀释成适合浓度的标准工作溶液，现用现配；
实验用水为 Milli-Q 去离子高纯水。
1.2 仪器工作条件
1.2.1色谱
色谱柱： Eclipse Plus C 18 RRHD 柱（50 mm×3.0mm， 1.8 µm，美国安捷伦科技有限公司）或柱效相当的色谱柱；柱温： 35℃；进样体积： 5 µL ；流动相：A 相为 0.1% 甲酸水溶液， B 相为甲醇，流量为 0.3mL／min，梯度洗脱程序见表 1。

1.2.2质谱
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电离电压：3.0 kV ；去溶剂温度： 450℃；去溶剂气体流量： 800L／min ；母离子、子离子、驻留时间、传输电压和碰撞电压等参数见表 2。

1.3 样品处理
称取约 0.5 g 油脂样品（精确至 0.01 g），用乙酸乙酯 – 环己烷（1：1）定容至 10 mL，定容液经凝胶渗透色谱仪净化，收集流出液，用氮气吹至近干，并用初始流动相定容至1 mL，供LC–MS／MS仪测定。
2. 结果与讨论
2.1 提取溶剂及净化方式的选择
由文献可知，油脂中辣椒素的检测方法中提取溶剂多为甲醇、乙腈、正己烷及碱性溶液（例如 2% 氢氧化钠溶液）等，净化方式有直接提取浓缩、固相萃取或自填充柱净化。
笔者比较了甲醇直接提取浓缩进样、碱性溶液提取后用 C ₁₈ 固相萃取柱净化以及凝胶渗透色谱净化 3 种样品净化方法的测定结果。对一份阳性样品进行检测， 3 种净化方式的检测结果相对比例如图 1。

由图 1 可知，利用碱性溶液（如 2% 氢氧化钠溶液）提取并用 C ₁₈ 固相萃取柱（SPE）净化检测结果最高，凝胶渗透色谱 (GPC)净化次之，直接提取未净化法只有含量比较大的天然辣椒素检测出，其中C ₁₈ 固相萃取法和凝胶渗透法 3 种辣椒素总含量测定结果的比值为（1.0：0.8），结果相差不大。3 种不同处理方法有差别的原因在于，利用液相色谱 – 串联质谱仪检测目标物时，基质效应对检测结果影响很大。不同净化方法处理样品会有不同的基质效应，第三种方法直接提取未净化结果干扰最大，有两种辣椒素未检出。3 种样品处理方法中，固相萃取法处理检测结果最高，但是操作步骤较多，过程繁琐，需要经历用碱液后调节 pH 值、固相萃取柱净化、氮吹几个步骤；凝胶渗透色谱法检测结果稍低，但是过程简单，可称取适量食用油直接进凝胶渗透色谱仪进行分析。因此利用凝胶渗透色谱仪测定食用油中的辣椒素含量更为方便、快捷。

2.2 液相质谱条件优化
配制合适浓度的 3 种辣椒素混合标准溶液，利用软件自动优化得到 3 种辣椒素的子离子、传输电压及碰撞电压，在不同的去溶剂温度（450， 500，550， 600℃），不同的去溶剂气体流量（600， 700， 800L／min），不同的电离电压（1.0， 2.0， 3.0 kV）下比较了3种辣椒素的响应值，最终优化选择出本实验室去溶剂温度、去溶剂气体流量及电离电压分别为450℃， 800 L／min 及 3.0 kV，在此条件下 5 μg／L的 3 种辣椒素的响应值最高。3 种辣椒素结构很相似，它们的子离子都相同，特别是天然辣椒素和合成辣椒素性质很接近，在色谱柱上于同一时间出峰，但是它们的母离子不同，因此可以利用液相色谱 – 串联质谱仪进行定性和定量分析。天然辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素的多反应监测色谱图、总离子色谱图及 GPC 分段收集图分别见图 2～图 4。

2.3 净化条件的优化选择
辣椒素的前处理方法很多，主要有直接提取和固相萃取净化两种。直接提取法对仪器污染严重；固相萃取方法步骤多，操作过程繁琐。凝胶渗透色谱（GPC）采用合适孔径的惰性多孔材料做固定相，基于分子的空间排阻效应大小将分子大小不同的物质分离。食用油中的油脂等高分子化合物在 GPC 柱上保留很弱，较快流出色谱柱；而小分子有机物则被保留在柱上，从而达到除去样品中大分子基体物质的目的。
为了确定凝胶渗透色谱的收集时间，用乙酸乙酯 – 环己烷 (1：1) 配制 100 ng／mL 的 3 种辣椒素的混合标准溶液，通过凝胶色谱后分段收集，用氮气吹干后以初始流动相定容并进行分析。由图 4可以看出，辣椒素从 6 min 开始至 12 min 出峰，第12～14 min 有少量洗脱，因此根据分段收集图最终确定 GPC 的条件为初始 6 min 不收集，收集中间 7min，最后用 6 min 冲洗净化柱。因为 12～14 min 有少量被测物洗脱出来，所以最终选择收集到13 min。
2.4 线性范围与检出限
按照优化好的实验条件，配制合适浓度的辣椒素标准工作溶液进行测定，以目标物定量离子的色谱峰面积为 y 轴，分析物质量浓度为x轴，绘制 3 种辣椒素的标准工作曲线。实验结果表明，在0.5～5.0 μg／L 范围内， 3 种辣椒素定量离子的色谱峰面积与对应标准溶液的质量浓度呈良好的线性关系，天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的线性方程分别 y=143 797x–4 145， y=74 299x–2 031，y=99 976x–2 751 ；相关系数分别为 0.999 6， 0.998 8，0.999 8。以空白样品添加不同浓度的辣椒素标准溶液，按照优化条件经过前处理后上机测定，取信噪比S／N 为 3 时的出峰浓度为检出浓度，并依据稀释倍数计算得出 3 种辣椒素的方法检出限 (LOD) 均为0.5 μg／kg。
2.5 加标回收试验
分别准确称取 6 种不同的食用油样品（3 种辣椒素本底含量均为 0），分别添加 5.0， 1.0 μg／kg 两种辣椒素标准品，按上述方法进行加标回收试验，试验结果列于表 3。由表 3 可知， 6 种食用油样品两水平加标回收率为 71.5%～82.5%，回收率的相对标准偏差为3.0%～8.3%。测定精密度和准确度满足分析要求。

3. 结论
建立了检测油脂中天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素含量的凝胶渗透色谱 – 液相色谱 – 串联质谱法。该法操作简便，定性、定量准确，重复性好，灵敏度高，样品前处理过程简便快捷，可满足实验室大量、快速分析的需求。

（摘自：北京标准物质网；相关产品咨询电话：010-58103778）

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