酵母双杂交检测（YeastTwo-HybridAssay）产品专题

2017-04-06 12:02阅读：

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酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题

检测原理：
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是用于体内研究蛋白相互作用的一种非常便利的工具，常用的如GAL4为基础的系统，使用酵母转录因子GAL4来检测转录激活后的蛋白相互作用。某些转录因子（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独立的结构域组成，N端有一个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）结合，而AD能激活UAS下游基因进行转录。单独的BD

SPAN>AD不能激活基因转录，两者只有通过某种方式结合在一起形成完整的转录激活因子的功能【见图1】。酵母双杂交系统主要利用酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱、瞬间的作用都能通过报告基因敏感的检测到。

酵母双杂交系统应用：
1）对新的与已经蛋白相互作用的鉴定
2）对预测蛋白相互作用的确认
3）对蛋白相互作用区域的鉴定

图1. 双杂交检测原理图。两个蛋白分别表达，一个（诱饵蛋白bait protein）融合到Gal4 DNA结合域表达，另一个（诱捕蛋白prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋白之间相互作用并结合到Gal4反应性启动子上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。

酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
一、诱饵（the bait）
为了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推荐使用质粒pGBKT7；
要调查三元蛋白复合物，推荐使用含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二个感兴趣蛋白，在bait和prey蛋白之间发挥桥梁作用。

二、检测蛋白作用的四个报告基因
Matchmarker gold系统是采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统（见图2）。其采用新型稳定的酵母双杂交抗生素- 金担子素Aureobasidin A （AbA）（货号：MS0002-1ML），可有效杀死非抗性克隆，从而大大降低背景克隆生长。同时有效缩减假阳性，由于人和prey蛋白单独将结合引起假阳性都需要识别3个不同序列，激活4个报告基因的表达。
4个报告基因分别是：1个AbA抗生素筛选报告基因，2个营养筛选报告基因，1个蓝白斑筛选报告基因。
1） AUR1-C
AUR1基因的主要突变版，能够表达肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。当蛋白发生作用促使GAL4转录激活，AUR1-C基因进行表达。酿酒酵母中此基因的表达孵育其对高毒抗生素金担子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景极其低，这一筛选报告子由于单一的营养缺陷报告子。
2） HIS3
Y2HGold菌株不能合成组氨酸，从而无法在缺少这一必须氨基酸的培养基上生长。当诱饵和诱捕蛋白相互作用，Gal4反应性的His3表达促使细胞合成组氨酸并能在His缺陷培养基上生长。
3） ADE2
Y2HGold菌株无法在不含腺嘌呤的基本培养基上生长，但当两个蛋白相互作用，Ade2表达被活化，细胞能在Ade缺陷的基础培养基上生长。
4） MEL1
MEL1编码α-半乳糖苷酶，存在许多酵母菌内的天然表达蛋白。当双杂交发生，MEL1表达和分泌，在底物X-α-Gal（货号：MF2003-25MG）存在的情况下，酵母菌落变为蓝色。

三、三个不同的结合位点（three different binding sites）
Y2HGold菌株三个启动子控制4个报告基因是不相关的，除UAS区域的短蛋白结合位点特异性结合Gal4 DNA-BD。因此，诱捕蛋白（文库蛋白或靶蛋白）与UAS内部或边缘的不相关序列作用（假阳性）就会自动被筛查出来。

图2. Matchmarker酵母菌株的报告基因构造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C报告基因分别由三个完全异源的Gal4反应启动元件-G1，G2，M1操控。而启动子内的蛋白结合位点是不同的，虽然每一个结合位点与Gal4识别的17-mer共有序列相关联。
酵母双杂交系统操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
完整的Matchmarker筛选过程包含以下步骤：
第一步：执行对照实验；
第二步：诱饵载体的构建及自我激活和毒性检测；
第三步：筛选Mate&Plate文库
第四步：确认和阐释结果

酵母双杂交检测需要产品信息：
我司（懋康生物）提供酵母双杂交研究需要的一系列产品，从酵母菌株、酵母质粒、酵母培养基到筛选标志（抗生素），欢迎来电咨询，电话：021-54736159，QQ：2971634497。
一、富集培养基（Rich Medium 酵母培养）

货号	名称	规格	价格（元）
MS6301-350G	YPD Agar Medium YPD琼脂培养基	350g	550
MS6302-250G	YPD Medium YPD液体培养基	250g	438
MS6303-350G	YPDA Agar Medium YPDA琼脂培养基	350g	550
MS6304-250G	YPDA Medium YPDA液体培养基	250g	438

【补充描述】：
1） YPD是用于大多数酵母菌生长所需的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖优化配比后组成的混合物；
2） YPDA培养基是在YPD基础上添加硫酸腺嘌呤，终浓度120 µg/ml。

二、基本培养基（Minimal Medium 酵母培养）

货号	名称	规格	价格（元）
MS6311-467G	Minimal SD Agar Base SD琼脂基础培养基	467g	1428
MS6312-267G	Minimal SD Base SD基础培养基	267g	768
MS6313-270G	Minimal SD Agar Base Gal/Raf SD琼脂基础培养基（含半乳糖/棉子糖）	270g	1428
MS6314-185G	Minimal SD Base Gal/Raf SD基础培养基（含半乳糖/棉子糖）	185g	988

【补充描述】：
1） SD Medium：酵母菌用的基本的合成限定培养基（Minimal synthetically defined medium），包含氮源，碳源（葡萄糖，除非有特殊说明）和DO添加剂（Dropout Supplement）。
2） DO（Dropout Supplement or Solution）：特定氨基酸和核苷的混合物，添加到SD base内以配制SD Medium。DO缺少一种或者更多未转化酵母菌需要的营养成分使其在SD Medium上生长，作为营养筛选标志。

三、省却成分氨基酸混合物/氨基酸缺失混合物（DO Supplements ）

类型	名称	货号	规格	价格（元）
Single Dropout Supplements (SDO) 单一省却成分添加剂	DO Supplement -His	MS6316-10G	10g	418
	DO Supplement -Leu	MS6317-10G	10g	418
	DO Supplement -Trp	MS6318-10G	10g	418
	DO Supplement -Ura	MS6319-10G	10g	418
Double Dropout Supplements (DDO) 双省却成分添加剂	DO Supplement -His/-Leu	MS6320-10G	10g	418
	DO Supplement -His/-Ura	MS6321-10G	10g	418
	DO Supplement -Leu/-Trp	MS6322-10G	10g	418
	DO Supplement -Met/-Trp	MS6323-10G	10g	418
	DO Supplement -Trp/-Ura	MS6324-10G	10g	418
	DO Supplement -Trp/-His	MS6325-10G	10g	418
	DO Supplement -Ura/-Leu	MS6326-10G	10g	418
Triple Dropout Supplements (TDO) 三省却成分添加剂	DO Supplement -His/-Leu/-Trp	MS6331-10G	10g	418
	DO Supplement -His/-Leu/-Ura	MS6332-10G	10g	418
	DO Supplement -His/-Trp/-Ura	MS6333-10G	10g	418
	DO Supplement -Leu/-Met/-Trp	MS6334-10G	10g	418
	DO Supplement -Leu/-Trp/-Ura	MS6335-10G	10g	418
	DO Supplement -Trp/-His/-Ade	MS6336-10G	10g	418
Quadruple Dropout Supplements (QDO) 四省却成分添加剂	DO Supplement -Ade/-His/-Leu/-Trp	MS6341-10G	10g	418
	DO Supplement -His/-Leu/-Met/-Trp	MS6342-10G	10g	418
	DO Supplement -His/-Leu/-Trp/-Ura	MS6343-10G	10g	418

四、 酵母营养缺陷完全培养基（SD+DO Supplments）

类型	名称	货号	规格	价格（元）
SD + DO Broth酵母缺陷型完全培养基（肉汤）	SD/-His Broth	MS6361-5L	5L	838
	SD/-Leu Broth	MS6363-5L	5L	838
	SD/-Trp Broth	MS6365-5L	5L	838
	SD/-Ura Broth	MS6367-5L	5L	838
	SD/-His/-Leu Broth	MS6381-5L	5L	838
	SD/-His/-Ura Broth	MS6383-5L	5L	838
	SD/-Leu/-Trp Broth	MS6385-5L	5L	838
	SD/-Met/-Trp Broth	MS6387-5L	5L	838
	SD/-Trp/-Ura Broth	MS6389-5L	5L	838
	SD/-Trp/-His Broth	MS6391-5L	5L	838
	SD/-Trp/-Ade Broth	MS6393-5L	5L	838
	SD/-Ura/-Leu Broth	MS6395-5L	5L	838
	SD/-His/-Leu/-Trp Broth	MS6411-5L	5L	838
	SD/-His/-Leu/-Ura Broth	MS6413-5L	5L	838
	SD/-His/-Trp/-Ura Broth	MS6415-5L	5L	838
	SD/-Leu/-Met/-Trp Broth	MS6417-5L	5L	838
	SD/-Leu/-Trp/-Ura Broth	MS6419-5L	5L	838
	SD/-Trp/-His/-Ade Broth	MS6421-5L	5L	838
	SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Broth	MS6431-5L	5L	838
	SD/-His/-Leu/-Met/-Trp Broth	MS6433-5L	5L	838
	SD/-His/-Leu/-Trp/-Ura Broth	MS6435-5L	5L	838
SD + DO with Agar酵母缺陷型完全培养基（琼脂）	SD/-His with Agar	MS6362-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Leu with Agar	MS6364-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Trp with Agar	MS6366-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Ura with Agar	MS6368-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Leu with Agar	MS6382-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Ura with Agar	MS6384-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Leu/-Trp with Agar	MS6386-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Met/-Trp with Agar	MS6388-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Trp/-Ura with Agar	MS6390-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Trp/-His with Agar	MS6392-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Trp/-Ade with Agar	MS6394-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Ura/-Leu with Agar	MS6396-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Leu/-Trp with Agar	MS6412-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Leu/-Ura with Agar	MS6414-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Trp/-Ura with Agar	MS6416-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Leu/-Met/-Trp with Agar	MS6418-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Leu/-Trp/-Ura with Agar	MS6420-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Trp/-His/-Ade with Agar	MS6422-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar	MS6432-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Leu/-Met/-Trp with Agar	MS6434-5L	10×0.5 L	1078
	SD/-His/-Leu/-Trp/-Ura with Agar	MS6436-5L	10×0.5 L	1078

五、筛选抗生素（底物）

货号	名称	规格	价格（元）
MS0002-1ML	Aureobasidin A （AbA）金担子素A（1 mg/ml）	1ml	900
MF2003-25MG	X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷	25mg	285
MF2001-1G	X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷	1g	280

【补充描述】：
1）Aureobasidin A （AbA）金担子素A是报告基因AUR1-C的筛选抗生素，以判断酵母菌是否能表达赋予其AbA抗性的酶。
2）X-α-Gal是α-半乳糖苷酶（由MEL1基因编码）的底物，当双杂交发生时MEL1报告基因正常表达催化底物发生颜色反应，使得酵母菌落呈蓝色。
3）X-Gal是ß-半乳糖苷酶（由lacz基因编码）的底物。

六、酵母质粒提取试剂盒

货号	名称	规格	价格（元）
D3376-01	酵母质粒抽提试剂盒 Yeast Plasmid Kit（Omega Biotek）	50次	495

【试剂盒工作原理】：
该试剂盒把硅胶柱纯化技术同经典的SDS碱裂解法结合起来，用户可在1小时内从酵母培养液中纯化出高纯度的质粒DNA。纯化过程不需用任何到有害的有机物抽提，亦不需用到耗时的乙醇沉淀。质粒DNA的产量依赖于酵母携带质粒的拷贝数，酵母菌株以及生长条件。一般来说，酵母质粒的拷贝数较低，5.0ml过夜培养液中质粒DNA产量约为1.0 µg左右。纯化的质粒可直接用于酶切，PCR,电转化等应用。酵母收集后,加入破壁酶和玻璃珠去除细胞壁,用传统碱裂法裂解细胞，然后将获得的上清液转移至结合柱结合DNA，经过两次快速洗涤，最后用无菌水洗脱出质粒DNA。

七、酵母转化试剂盒

货号	名称	规格	价格（元）
MF2501-200T	Yeast Transformation Kit 酵母转化试剂盒	200T	768

【补充描述】：
酵母质粒转化试剂盒，含PEG/liAC酵母转化需要的所有试剂，操作简单，转化效率高。

八、酵母双杂交菌和感受态细胞

货号	名称	规格	价格（元）
MF2351-300UL	Y2HGold Yeast Strain 酵母双杂交用甘油菌	300μl	咨询
MF2352-100UL	Y2HGold Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞	100μl	咨询
MF2353-300UL	Y187 Yeast Strain 酵母双杂交用甘油菌	300μl	咨询
MF2354-100UL	Y187 Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞	100μl	咨询

九、酵母菌载体

货号	名称	规格	价格（元）
MF3601-20UL	pGBKT7 DNA-BD Vector 酵母双杂交克隆载体	20μl	咨询
MF3602-20UL	pGBKT7-53 Vector 酵母双杂交对照载体	20μl	咨询
MF3603-20UL	pGBKT7-Lam Vector 酵母双杂交对照载体	20μl	咨询
MF3604-20UL	pGADT7-AD Vector 酵母双杂交克隆载体	20μl	咨询
MF3605-20UL	pGADT7-T Vector 酵母双杂交对照载体	20μl	咨询
MF3606-20UL	pBridge Vector 酵母三杂交克隆载体	20μl	咨询
MF3609-20UL	pGBT9 Vector 酵母双杂交克隆载体	20μl	咨询

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持'品质保障'的原则为广大客户提供优质产品。

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