miRNA靶基因验证！

你是否发现非编码RNA（Non-coding RNA）的研究越来越火热？当一个新发现的miRNA是否对相关疾病有较显著的调控作用，这就需要我们先对它和靶基因的调控关系做一验证，接下来我们就介绍最常用的靶向关系验证方法：双荧光素酶报告基因检测。
（请耐心花2分钟阅读完本文，建议推荐给小伙伴一起学）
一. 检测原理
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面， 通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
二. 实验材料
仪器设备：荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、低速离心机、 血球计数板 、水浴锅、酶标仪；


统计学处理 GraphPad Prism作图
三. 实验步骤
主要分为：质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。
质粒转染细胞：
1、细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
2、转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。
1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly：Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl；
2) 配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试 剂每孔0.25μL；
3)