丰晖生物：pET-28a质粒图谱怎么看，如何看懂载体图谱~

2018-08-02 16:25阅读：

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丰晖生物：pET-28a质粒图谱怎么看，如何看懂载体图谱~

每个实验室都有各种各样的载体，每个实验阶段也在使用不同的载体。

那么，你对你使用的载体了解多少呢？

我随机采访了几个生物专业的硕士同学：

同学A（做大肠表达）： GEX-4T-2载体，大肠表达载体，大小约为5 kb，抗性为Amp，带有GST标签，有BamHI以及EcoRI酶切位点.....

我：那...有看过图谱吗？

同学A：木有

(｀Д´)!!

同学B（做酵母表达）： pPICZα/A载体，毕赤酵母表达载体，大小约为3.5kb，抗性为Zeocin

同学C（做大肠表达）：pET-28a(+)，载体，大肠表达载体，大小约为5.4kb，抗性为Kana，6xHis标签

...然而，他们都没有看过载体图谱!

那么，我们今天就来讲讲载体图谱！

其实，在美露的眼里，载体是这样的：
比如，pET-28a(+)

首先它是大肠表达载体，大小为5369 bp，胞内表达目的基因
然后，我们对其元件进行一个个的分析：

复制子：ColE1/pMB1/pBR322/pUC ori——起始载体的复制；f1 ori——f1噬菌体复制子，显示正义链合成方向
KanR：编码氨基糖苷磷酸转移酶，在原核细胞中产生卡那霉素抗性，在真核细胞中产生遗传霉素筛选标记
Rop：编码ROP蛋白，使得质粒维持低拷贝水平
乳糖操纵子元件——lacI promoter+ lacI (启动阻遏蛋白的表达，是lac operator的抑制因子)，lac operator（lac操纵基因，阻遏蛋白与之结合后抑制其后基因的表达，乳糖类似物IPTG可与阻遏蛋白结合从而失去对lac operator的控制，进而使得其后基因正常表达）
T7 promoter：受控于T7 RNA聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。
6xHis（6xHis亲和标签）：MCS区C端和 N端各有一个，编码6个连续的His，用来作为纯化目标蛋白的标签
throbin site：Thrombin蛋白酶切位点
T7 tag：提升翻译效率
MCS：多克隆位点区域
T7 terminator：受控于T7 RNA聚合酶的终止子

接下来是第二个载体
pPICZα/A

它是毕赤酵母表达载体，大小为3593 bp
整合型载体（将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达）
可将目的蛋白分泌到胞外
然后，它的元件：

ori：ColE1/pMB1/pBR322/pUC 复制子：起始载体的复制
AOX1 promoter：甲醇诱导型启动子，表明载体需要甲醇诱导才可表达
α-factor secretion signal：分泌信号肽，使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外
MCS：多克隆位点
Myc：载体标签，有对应抗体，可用于做 western-blot杂交应用中。
6xHis：（6xHis亲和标签）：MCS区C端和 N端各有一个，编码6个连续的His，用来作为纯化目标蛋白的标签
AOX1 terminator：转录终止子
TEF1 promoter：EF-1α启动子-在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
EM7 promoter：细菌启动子-在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
BleoR：Zeocin抗性基因
CYC1 terminator：转录终止子

当然，有时候并不需要你这么仔细的去分析载体
但是对于载体的基本元件还是要知悉的，比如载体启动子，抗性元件，多克隆位点，载体标签
当你看懂了这些元件后，你就会懂得：为什么这个载体是诱导型载体？为什么这个载体可以用XX标签纯化？等等
但是有很多小伙伴表示不会看载体图谱
那么美露就来分享一下多年以来的经验

1.准备工作：