在废水处理中形成悬浮絮凝物和固定生物膜是异养反硝化的两种常用策略。这两种策略使用不同的碳源进行微生物聚集，其具有不同的生态位。作者假设这两种具有不同生态位的微生物聚集具有不同的微生物结构和代谢适应性。通过研究3个絮凝反硝化反应器和3个生物膜反硝化反应器，确定是否存在明显的微生物聚集。利用多组学方法来确定微生物群落组成，共现网络和代谢途径。研究结果表明：Proteobacteria是所有样本中最主要且最活跃的门；碳源在塑造微生物群落组成中起重要作用；而功能蛋白的分布在很大程度上受盐度的影响。我们发现拓扑网络特征具有不同的生态模式，生物膜反应器中的微生物比絮凝反应堆中的网络节点更多，但相互作用更少。生物膜反应器中生态位的巨大差异性可以很好地解释高微生物多样性，功能冗余和由此导致的系统高稳定性。此外与絮凝反应器相比，生物膜反应器中反硝化菌比例较低，对氧气和盐度扰动的抵抗力较高。研究结果支持作者的假设，即生态位差异导致不同的微生物结构，增加的微生物生态分布，这有助于提高系统效率和稳定性。
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在废水处理中形成悬浮絮凝物和固定生物膜是异养反硝化的两种常用策略。这两种策略使用不同的碳源进行微生物聚集，其具有不同的生态位。作者假设这两种具有不同生态位的微生物聚集具有不同的微生物结构和代谢适应性。通过研究3个絮凝反硝化反应器和3个生物膜反硝化反应器，确定是否存在明显的微生物聚集。利用多组学方法来确定微生物群落组成，共现网络和代谢途径。研究结果表明：Proteobacteria是所有样本中最主要且最活跃的门；碳源在塑造微生物群落组成中起重要作用；而功能蛋白的分布在很大程度上受盐度的影响。我们发现拓扑网络特征具有不同的生态模式，生物膜反应器中的微生物比絮凝反应堆中的网络节点更多，但相互作用更少。生物膜反应器中生态位的巨大差异性可以很好地解释高微生物多样性，功能冗余和由此导致的系统高稳定性。此外与絮凝反应器相比，生物膜反应器中反硝化菌比例较低，对氧气和盐度扰动的抵抗力较高。研究结果支持作者的假设，即生态位差异导致不同的微生物结构，增加的微生物生态分布，这有助于提高系统效率和稳定性。
实验设计
1 反应器配置及反硝化性能测试
反应器配置和运行条件如表1所示。三个固相生物膜反应器使用聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作为碳源：SA0和SA25是缺氧固定床反应器; SS25是需氧/缺氧序列分批反应器(Ruan等，2016)。LA0和LA25是两个缺氧液相絮凝反应器，它使用乙酸钠 (NaAc)作为碳源将水中C/N比调节到10。SA0、SA25、SS25、LA0和LA25均在实验开始前用从当地污水处理厂收集的活性污泥接种，并用与流入物相同的再循环水产养殖废水进料。从当地的全规模猪场废水处理厂(WWTP)取样LS0 (盐度，0‰)，该处理装置在序批处理条件下操作。根据标准方法 (SEPA，2002)测量进水和出水中的硝酸盐浓度，并根据先前的研究计算硝酸盐去除百分比和反硝化速率。
表1：介绍六座反应器的运行条件和反硝化性能。
2 样品准备
从三个生物膜反应器中分别取50g PBS颗粒，加入50mL高压灭菌的软化水稀释，通过超声处理收集附着的生物膜材料，具体方法详见之前的研究。而三个絮凝反应器中的样品则在充分混合后各收集50 mL。RNA-固定剂(RP1301, BioTeke Corporation, China)用于所有样品以抑制RNA的降解。将所有细菌样品通过0.22 μm无菌膜 (GTTP, Millipore-Isopore)过滤，将收集的滤膜置于液氮中保存以用于后续的基因组DNA，RNA和蛋白质提取。
3 核酸提取与测序
基因组DNA和RNA利用Omega的E.Z.N.A.™ DNA/RNA/Protein Isolation Kit提取试剂盒提取。提取后RNA首先转逆转录为cDNA并定量。而16S-rRNA or 16S-rDNA genes (V3-V4区)则用引物341F (50-CCTACGGGNGGCWGCAG-30) 和805R (50-GACTACHVGGGTATCTAATCC-30) 进行扩增扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用纯化Agencourt AMPure XP Beads (A63881, Beckman, USA)进行纯化。纯化后的PCR产物通过Illumina MiSeq测序平台进行测序分析。
4 nosZ、16S rRNA 和rDNA基因丰度测定
使用SYBR Green Real Time PCR Kit (Novland, Shanghai, China)对nosZ、16S rRNA或逆转录产物cDNA样品进行定量扩增。将基因拷贝数均一化为每纳克DNA或RNA中的基因拷贝数，并表示为细菌细胞数，因为每个细菌细胞的16S rDNA拷贝数平均为4.2，而nosZ基因通常携带一个拷贝。nosZ和16S rRNA基因的标准曲线的扩增效率分别为100％ (R2=0.999)和97％ (R2=0.999)。
5 蛋白提取及蛋白质组学分析
使用SDS裂解法提取蛋白质，详尽步骤间文献Wang et al. (2012)。使用Bradford蛋白质测定试剂 (B6916, Sigma, USA)作为标准品测定蛋白质浓度。根据我们之前的研究进行蛋白质组学分析。简言之，通过胰蛋白酶消化100 μg蛋白质，并使用来自iTRAQ试剂盒 (Applied Biosystems, California, USA)的化学品标记所得肽混合物。使用强阳离子交换色谱 (SCX)柱纯化标记的样品，然后使用LC-20AB HPLC系统 (Shimadzu，Japan)通过液相色谱 (LC)分离。使用与TripleTOF 5600质谱仪 (AB Sciex，Concord，ON)接口的反相液相色谱系统(Eksigent)，通过MS / MS分析iTRAQ标记的样品。通过AB ProteinPilot v4.5软件(Applied Biosystem，USA)分析来自三个生物重复的iTRAQ数据，并通过Uniprot数据库 (www.uniprot.org)进行蛋白质/多肽注释。检测的蛋白质代谢路径通过KEGG数据库进行比对。
6 数据分析
首先使用质量控制程序检测高通量测序的原始数据，并使用PRINSEQ软件(PRINSEQ-lite 0.19.5，日本)除去低质量序列。然后使用FLASH v.1.2.7软件(https://sourceforge.net/projects/flashpage)合并clean数据以形成长度> 400 bp的序列。使用具有SILVA 16S数据库的Uchime软件除去嵌合体，并使用Mothur软件 (https://www.mothur.org/)中的pre.clust校正测序错误。最后得到的高质量序列根据相似性>97％的聚为一个操作分类单位 (OTU)。选择一个OTU中最丰富的序列作为该OTU代表序列进行生物学分类。利用Mothur软件确定OTU丰富度和α多样性指数 (即Shannon多样性指数，Chao1丰富度估计量和基于丰度的覆盖度估计量 (ACE)。分别在门水平和属水平上进行热图和PCoA分析，以比较所有反应器中细菌群落的组成和分布。
结果
1. 6个反应器的反硝化过程
该研究中六个反应器的硝酸盐去除百分比和反硝化速率详见表1。在生物膜反应器中，PBS同时用作生物膜载体和碳源，不添加任何液体碳源，生物膜附着在惰性介质可获得更长的污泥滞留时间 (SRT)。在较高的盐浓度和相同的进水硝酸盐负荷下，SA25的硝酸盐去除率和反硝化率均高于SA0。虽然SA25和SS25在相同的盐度条件下具有相似的硝酸盐去除率和反硝化率，但使用了不同的HRT和通气策略。在反应器运行60天后，LA0和LA25之间没有发现显著的反硝化速率差异性。
研究结果表明，反硝化速率不受生物膜反硝化反应器中盐度(25‰)或间歇曝气的影响。这与先前的研究相反，之前报道盐度增加或间歇供氧总是通过抑制酶或与反硝化菌的电子竞争降低絮凝体系中的硝酸盐去除性能。在生物膜反应器中，在介质表面聚集的细菌可在生物膜内层产生缺氧环境，因为外层细菌在深入生物膜层之前消耗氧气。这种生态位使得兼性需氧细菌能够利用硝酸盐进行反硝化，使细菌能够承受轻微的氧气冲击。在LA0和LA25中，由于几乎完全去除了硝酸盐，人们可以认为没有达到最大的反硝化速率。LS0的高反硝化速率可以通过较高的进水硝酸盐负荷和较高的污泥浓度来解释，而LA0和LA25不行。
2. 微生物群落组成分析
除了反应器SS25和LA25之外，通过TS序列计算得到的丰富度和生物多样性比通过GS计算得到的更低。与絮凝反应器 (即LA0、LA25和LS0)相比，生物膜反应器 (即SA0、SA25和SS25)显示出更高的细菌多样性。施加淀粉/聚乳酸混合物的生物膜脱氮系统比添加乙醇的系统具有更高的生物多样性。在生物膜系统中观察到的高多样性可能是生物膜系统的异质性和降解后碳源复杂性的结果，因为生态位可能能增加微生物多样性。相反，絮凝体系中养分的均匀分布往往会产生优势物种，从而降低了微生物的多样性。在生物膜反应器中，GS和TS序列数据计算均发现SA0具有最高的细菌丰富度和多样性，而在絮凝反应器中，LA0的多样性最低 (表S2)。营养不足的培养基可以产生更高的生物多样性，而当营养资源充足时，多样性反而会损失。SA0中较低的硝酸盐去除效率和由此产生的碳限制环境可以解释SA0的高度多样性。同样，LA0中高硝酸盐去除效率和由此产生的高碳环境也可以解释LA0中出现的最低多样性。此外，样品通过GS (生物膜反应器，4.9％;絮凝反应器，0.2％)数据分析得到的结果的共享OTU数高于通过TS (生物膜反应器，2.1％;絮凝反应器，0.0％)数据分析得到的结果 (图S1)。这表明，虽然通过DNA测序得到的结果显示样品间存在大量的共享OTU，但通过RNA测序的结果显示样品之间的OTU重叠度仍相对较低。
图1：6个反硝化反应器中微生物系统发