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多肽合成-设计一种新型细胞穿膜肽嵌合体，以促进伤口愈合

2019-02-25 16:26阅读：

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多肽合成-设计一种新型细胞穿膜肽嵌合体，以促进伤口愈合
所研究的肽的结构表征。A）在10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中以20μm的肽浓度获得圆二色（CD）光谱.B）在另外存在50％TFE时获得的光谱，C）计算的α-螺旋含量的百分比，D ）由HeliQuest预测的Tylotoin-sC18 *和sC18 * -Tylotoin的螺旋轮投影。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-018-34684-1。
细胞穿透肽（CPPs）作为医学中的递送载体引起了极大的兴趣，具有开发新型治疗剂或化妆品的潜力。生物膜通常对几乎所有分子量大于500Da的化合物都是不可渗透的。在最近的一项研究中，Mareike Horn和Ines Neundorf将伤口愈合促进序列（Tylotoin）与细胞穿透肽共价偶联，以改善药物跨细胞膜的共价偶联递送。用内化研究观察到这些新型肽缀合物对角质形成细胞的细胞摄取，以显示具有良好耐受性的显着改善的递送。

在研究中在划痕伤口闭合测定中研究了有希望的新型肽嵌合体（Tylotoin-sC18 *）以了解其伤口愈合能力。结果表明，Tylotoin与肽的融合不会导致其活性丧失。此外，观察到其对角质形成细胞的增殖作用是伤口愈合过程中的重要步骤。Tylotoin-sC18 *表现出强大的抗菌活性，可预防伤口细菌感染。由于它们的多种功能，作者假设新的肽嵌合体可用于治疗感染的伤口作为未来的药剂。结果现已发表在科学报告上。



由烧伤或疾病引起的皮肤损伤需要有效的伤口处理以促进公共健康和经济，从而形成医疗保健中的普遍焦点。通过皮肤递送治疗性和活性分子正受到相当大的科学关注，但是皮肤的细胞膜不可渗透性是非常难以克服的。因此，在过去十年中发现的细胞穿透肽（杭州专肽生物www.allpeptide可提供40余种不同序列的穿膜肽，另可定制其它序列的多肽）已经形成了一种在生物膜上递送大分子的有希望的方法。


结构相对较短，CPP长度小于40个氨基酸，具有高度正电荷。该序列能够跨细胞膜携带静电或共价结合的生物活性货物，包括质粒DNA，siRNA和治疗性蛋白质。在这种情况下，所提出的细胞内化机制包括内吞过程和通过孔的直接易位。运输分子的触发因素及其确切机制仍然未知。


近年来已经在使用CPP作为新型透皮递送系统以在化妆品工业中提供更安全的替代方案方面做出了巨大努力。例如，在炎性皮肤病的治疗中，环孢菌素A与聚精氨酸-7连接形成R7-CsA。最近，融合蛋白被设计为具有四种结构类别的CPP，其中人表皮生长因子（hEGF）作为伤口愈合剂。
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肽内化成角质形成细胞。A）与10μMCF标记的肽孵育30分钟后的荧光图像，绿色：羧基荧光素标记的肽; 蓝色：Hoeschst 33342核蓝色斑点。B）孵育30分钟后细胞中CF标记的肽的相应流式细胞术摄取研究。实验一式三份进行，n = 3。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-018-34684-1。


在本研究中，Horn和Neundorf报道了一种名为sC18的细胞特异性细胞穿透肽与称为Tylotoin的伤口愈合肽序列的融合。最近鉴定了短肽Tylotoin并从蝾螈 Tylototriton verrucosus 的皮肤中分离出来。评估新型缀合物对角质形成细胞和研究中的癌细胞系的细胞毒性，以观察细胞内化行为和肽对体外伤口愈合的影响。



作者合成了含有Tylotoin的嵌合肽和在同一研究组内开发的CPP sC18。该研究还包括截短形式的sC18，其缺少来自C末端的四个氨基酸，称为sC18 *。然后将CPP在C末端或N末端与Tylotoin融合，产生四种肽嵌合体，其通过先前描述的方法合成。使用圆二色（CD）光谱法测定肽的二级结构。


为了消除潜在的伤口愈合剂的细胞毒性，作者接下来研究了肽对人永生化角质形成细胞（HaCaT）的细胞活力。结果显示单独的Tylotoin-sC18，sC18 *和Tylotoin-sC18 *对角质形成细胞没有细胞毒性作用。使用CF标记的肽使肽内化为角质形成细胞。所有肽都被内化，并且嵌合肽显着地在细胞溶质和核仁中显示出强烈的分布。


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Tylotoin-sC18 *及其前体肽与模型膜的相互作用。将CF标记的肽（20μM）与A）中性和B）带负电荷的巨单层囊泡（GUV）一起孵育90分钟，并通过荧光显微镜分析。用0.2mol％的Atto550-DOPE（红色染料）标记囊泡膜。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-018-34684-1。



在下一级实验中，作者使用称为巨单层囊泡（GUV）的人工膜系统研究了细胞进入分子水平的最初步骤。GUV由两性离子脂质组成，以确保更好的细胞相容性。在该研究中，作者使用CF标记的Tylotoin-sC18 *与荧光标记的CF-Tylotoin和CF-sC18 *作为对照，在90分钟时与中性GUV和阴离子GUV孵育。肽不会显着积聚在中性GUV的膜上。相反，当阴离子GUV与荧光标记的蛋白质一起孵育时，除了CF-泰乐菌素外，检测到强肽信号。Tylotoin-sC18 *与阴离子脂质膜的相互作用导致显着的染料释放以完全染色整个囊泡。


为了检测嵌合Tylotoin-sC18 *对伤口愈合的影响，作者使用划痕伤口愈合测定法并观察角质形成细胞迁移。在Tylotoin-sC18 *的存在下，角质形成细胞向伤口区域的迁移在刮擦后30小时明显增加。用人表皮生长因子（hEGF）也观察到类似的结果。在该研究中设计的新型嵌合肽缀合物具有与Tylotoin和hEGF相当的迁移功效。
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评估嵌合肽对角质形成细胞迁移的影响。通过用移液管尖端刮擦表面使单层细胞受伤，并分别用13.5μMTylotoin-sC18 *，13.5μMTylotoin和100ng / mL hEGF处理。未处理的细胞用作对照。A）使用倒置光学显微镜在肽添加后0,7,25和30小时监测伤口闭合。B）每个时间点细胞覆盖区域的百分比。C）使用Wimasis图像分析分析以百分比/小时测量的伤口闭合的平均速度。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-018-34684-1


还在HeLa细胞中研究了新型肽缀合物的行为以了解其对癌细胞系的影响。CF-标记的Tylotoin-sC18 * HeLa细胞的特征在于与对照肽相比染料的极高摄取。该研究还有趣地显示Tylotoin-sC18 *诱导的癌细胞的活力降低，即使在较低浓度下也显着，暗示肽的潜在抗癌活性。



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Tylotoin-sC18 *对癌细胞的功效。A）用CF标记的Tylotoin-sC18 *在37处理30分钟的HeLa细胞的显微图像。B）通过流式细胞术在37下定量细胞摄取10μMCF标记的肽30分钟。C）用Tylotoin-sC18 *，sC18 *和Tylotoin处理24小时后HeLa细胞的细胞活力。用70％乙醇处理的细胞用作阳性对照。图片来源：Scientific Reports doi：10.1038 / s41598-018-34684-1



该研究还评估了内吞作用的抑制及其对细胞摄取Tylotoin-sC18 *对HaCaT细胞的影响。为了建立抑制内吞作用的条件并限制能量依赖性途径，将HaCaT细胞与Tylotoin-sC18 *在4温育。然而，作者观察到肽进入细胞的能力，在核仁中具有显着的定位，导致假设肽嵌合体可以通过直接易位内化。杭州专肽生物 专注于多肽 专业于多肽 服务科研


此外，肽sC18 *与Tylotoin的融合不会损害Tylotoin的固有愈合能力。如所观察到的，嵌合肽通过诱导角质形成细胞的迁移和增殖来增加愈合能力以促进体外伤口闭合。与抗微生物特性相结合，新型细胞穿透嵌合肽Tylotoin-sC18 *可用作感染伤口治疗的新型局部药物。


更多信息： Mareike Horn等。设计一种促进伤口愈合的新型细胞渗透性嵌合肽，Scientific Reports（2018）。DOI：10.1038 / s41598-018-34684-1
Lixian Mu等。来自蝾螈皮肤的潜在伤口愈合促进肽，FASEB Journal（2014）。DOI：10.1096 / fj.13-248476
M. Horn等。通过使用三唑桥的分子内环化来调整新型短细胞穿透肽的性质，Chemical Communications（2015）。DOI：10.1039 / C5CC089

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