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关于CRISPRCas9基因编辑技术

2019-01-25 17:29阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/6972657357

划重点:
1.本文首先介绍了CRISPR Cas 系统是什么，以及它是如何帮助细菌瓦解噬菌体的攻击。
2.其次简单介绍三种不同类型的CRISPR Cas 系统及其分类依据
3.最后介绍两个验证CRISPR Cas 9可用于基因编辑的实验。



CRISPR的全称是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（规律成簇的间隔短回文重复），为大多数细菌及古细菌中特有的用于抵御噬菌体入侵的功能基因簇。一般的CRISPR基因簇由一系列Cas 基因和CRISPR序列组成，其中Cas 基因可以转录和翻译成蛋白质，用于DNA切割；而CRISPR 序列包含一些相间排列的间隔区（spacer）和重复序列区(Direct repeats), 其中间隔区序列来源于外源DNA中的原间隔序列（protospacer）, CRISPR 序列可被转录和加工得到小型的crRNA，用于DNA识别。
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图一 三种不同类型的CRISPR Cas 系统
那么这个神奇的基因簇是如何发挥免疫功能来保护细菌的健康成长呢？当噬菌体攻击细菌时会将其DNA注入到细菌体内，从而引发细菌体内的Cas蛋白表达激活并从噬菌体的DNA中截取一个长度为20 bp的原间隔序列（protospacer）存放到CRISPR 序列中变成间隔序列(spacer）；值得注意的是，原间隔序列的下游紧邻原间隔序列临近基序（PAM），PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。之后另一些用于外源DNA切割的Cas蛋白也会被表达，而CRISPR序列会被转录得到pre-crRNA并经进一步加工得到小型成熟的crRNA，正是这个crRNA通过间隔区序列与目标DNA互补配对的方式引导Cas 蛋白对噬菌体DNA实现特异性切割, 切割位点就在靠近PAM序列上游的地方；最终噬菌体DNA会被完全CRISPR Cas系统完全降解摧毁。 关于CRISPRCas9基因编辑技术
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图二 crRNA引导Cas蛋白对目标DNA进行特异性切割

目前已发现有3种不同类型的CRISPR cas 系统被细菌用于摧毁外源入侵的DNA。不同的类型可根据pre-crRNA 的成熟方式和表达的Cas蛋白的类型进行划分。如图一所示，在CRISPR cas I 型系统中，pre-crRNA经CRISPR相关的核糖核酸酶切割处理得到小型成熟的crRNA.，然后它会和多个cas功能蛋白形成一个大的复合物对目标DNA进行识别；之后，cas3核酸酶才被招募到目标DNA对其进行切割降解；在II型系统中，pre-crRNA的成熟则依赖于trans-crRNA的表达， trans-crRNA 和pre-crRNA中的重复序列互补配对形成二聚物，进而引发内源性III型 RNA核酸酶对pre-crRNA进行切割以形成小型成熟的crRNA; 之后crRNA和Cas9蛋白形成复合物便可直接对目标DNA进行识别和切割；在III型系统中pre-crRNA首先经CRISPR相关的核糖核酸酶切割处理得到小型的crRNA，之后再经一种未鉴定的RNA酶处理得到完全成熟的crRNA；crRNA与多个cas蛋白形成一个大的复合物对目标DNA进行识别和切割。其中最简单的II型系统(CRISPR Cas 9)便被聪明的人类开发成当下最热，发展最快，应用最为广泛的RNA介导的定向基因编辑技术。
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图三 CRISPR Cas 9 进行基因编辑的机制
在CRISPR Cas9 系统中，trans-crRNA 和crRNA 形成二聚物后共同引导Cas 9蛋白到目的基因对其进行位点特异性切割，而改变crRNA 中的间隔区(图四黄色部分序列)则可实现对不同的目的DNA片段进行切割。这一结论是否可靠还是需要科学证据来证明的，如图4所示，科学家们根据目标DNA的核苷酸序列设计了相应的crRNA 和tracrRNA用于构建CRISPR Cas 9 系统，并分别检测其是否能对目标DNA 和含目标DNA 的序列进行切割。双链DNA中可与crRNA-sp2配对的单链叫做互补单链DNA，另一条不可与crRNA-sp2配对的单链叫做非互补单链DNA。下面就来看看科学家们是如何设计实验来证明CRISPR Cas9系统确实可用于定向基因编辑的吧.
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图四 CRISPR Cas9 系统中目标DNA，crRNA 和 tracrRNA 的关系
实验一，DNA分子裂解分析
1实验目的: 证明cas 9能够对目标DNA分子进行切割
2 实验对象：单链DNA分子和双链DNA分子
3 实验方法
3.1对DNA分子进行放射性标记：
3.1.1将DNA寡核苷酸(10 pmol)和5单位T4多核苷酸激酶（New England Biolabs）以及~3-6 pmol（~20-40 mCi）[γ-32P] -ATP（Promega）于1X T4多核苷酸激酶反应缓冲液中孵育30分钟，温度为37℃， 反应总体积为50ul.

3.1.2将反应温度提升至65℃孵育20分钟以终止反应。反应产物用Illustra MicroSpin G-25柱（GE Healthcare）纯化以除去未标记的DNA。
3.1.3将退火标记的寡核苷酸与等摩尔量的未标记的互补寡核苷酸在95℃下孵育3分钟，然后缓慢冷却至室温，从而得到标记的单链DNA分子和未被标记的单链DNA分子。
3.2DNA分子裂解分析
3.2.1将tracrRNA和crRNA加热到95度保持30秒，然后缓慢冷却至室温。

3.2.2将DNA寡核苷酸 (1μl (~10 nM))，Cas 9蛋白(500 nM)，和退火的tracrRNA : crRNA复合物(500 nM, 1:1) 于裂解分析缓冲液((20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol) 中孵育60分钟，温度为37℃，反应总体积为9μl。
3.2.3加入20μl上样染料（5 mM EDTA, 0.025% SDS, 5% glycerol in formamide）以终止反应，并将反应温度加热至95℃，保持5分钟。
3.2.4裂解产物用含有7M尿素的12％变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，并通过磷光成像（Storm，GE Life Sciences）显现。
4 实验设计
对照组0：标记的互补单链DNA
实验组1：标记的互补单链DNA，未标记的非互补单链DNA
实验组2：标记的互补单链DNA，未标记的非互补单链DNA 和 Cas 9蛋白
实验组3：标记的互补单链DNA，未标记的非互补单链DNA，Cas 9蛋白和crRNA-sp2
实验组4：标记的互补单链DNA，未标记的非互补单链DNA，Cas 9蛋白，crRNA-sp2 和tracrRNA
实验组5：标记的互补单链DNA，未标记的非互补单链DNA，Cas 9蛋白，crRNA-sp1 和tracrRNA
实验组6：标记的互补单链DNA，Cas 9蛋白，crRNA-sp2 和tracrRNA

而当对照组为非互补单链DNA时，也进行了相同的实验设置，见 0’-6’.
5实验结果
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实验组4和4’表明cas9 蛋白能够直接对目标双链DNA分子进行切割。实验组6和6’表明cas9 蛋白能够对与crRNA 互补的单链DNA分子进行切割，却不能对非互补的DNA单链进行切割。DNA的切割位点可通过对裂解产物进行测序（图四蓝色箭头）和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（图四红色箭头和红色的线）两种方法得知.
实验二，质粒DNA裂解分析
1实验目的：证明cas 9能够对质粒DNA进行切割
2 实验对象：环形质粒DNA和线性质粒DNA
3 实验方法
3.1合成或体外转录得到tracrRNA和crRNA，将它们加热到95度然后缓慢冷却至室温。
3.2将质粒DNA (300 ng (8 nM))，Cas 9蛋白(50-500 nM)，和tracrRNA : crRNA复合物(50-500 nM, 1:1) 于Cas9质粒切割缓冲液(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA)中孵育60分钟，温度为37℃。

3.3用含有250mM EDTA的5X DNA上样缓冲液终止反应，实验结果由0.8或1％琼脂糖凝胶电泳解析显示。
4 实验设计
对照组1：质粒 -sp2 和Mg2+
实验组2：质粒 - sp 2 ，Mg2+ 和 Cas 9蛋白
实验组3：质粒 - sp2 ，Mg2+，Cas 9蛋白和crRNA-sp2
实验组4：质粒 - sp2 ，Mg2+，Cas 9蛋白，crRNA-sp2 和tracrRNA
实验组5：质粒 - sp2 ，Mg2+，Cas 9蛋白，crRNA-sp1 和tracrRNA
实验组6：质粒 - sp2 ， Cas 9蛋白，crRNA-sp2 和tracrRNA

5 实验结果

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