大鼠血管平滑肌细胞的培养步骤与应用！

2022-08-18 10:10阅读：

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大鼠血管平滑肌细胞的培养步骤与应用！

一、背景

大鼠血管平滑肌细胞是以大鼠主动脉为材料经过酶消化制的原代成纤维细胞细胞系。血管平滑肌细胞是许多重大动脉疾病的细胞底物。血管平滑肌细胞的不断增长是损伤性血管病变形成、动脉疾病发展的重要原因。体外培养血管平滑肌细胞是研究在血管病变发生过程中细胞及分子改变的基础。此外平滑肌细胞具有产生结缔组织和基质的功能，因此动脉平滑肌细胞是研究动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄以及高血压等疾病发病机制和防治工作的重要对象。

二、大鼠血管平滑肌细胞培养步骤

1、颈椎脱臼处死大鼠，75%酒精浸泡3～5min，无菌条件下打开胸腔，将大鼠左肺向右侧翻转，可见贴于脊柱右侧胸主动脉走行。上端沿主动脉弓，下端至膈的主动脉裂孔处，完整剪取胸主动脉，置于预先装有PBS的无菌培养皿中;

2、用镊子轻轻剥离血管外结缔姐织，移至另一装有PBS

的无菌培养皿;

3、用眼科剪沿纵轴剪开血管条，无菌镊轻轻刮除内膜，移至另一无菌培养皿;

4、用镊子钝性加压刮中膜2次,待出现裂口后夹住中膜将其取下;

5、将取下的中膜加入含20S的DMEM培养液，用眼科剪剪碎血管条，使组织块大小约1mm×1mm×lmm;

6、用无菌滴管将组织块吸入细胞培养瓶，均匀铺于瓶壁，间距约0.2～0.5cm;

7、将培养瓶直立放置于37/5%CO2细胞培养箱;

8、1h后轻轻放平，37/5%CO2细胞培养箱中绝对静置3d;

9、此后每3d换液1次;

10、培养出来的VSMC及时传代及冻存于液氮，3～8代用于后续实验。

三、应用

用于姜黄素抑制大鼠血管平滑肌细胞钙化的凋亡信号机制研究：

血管钙化（vascular calcification）指的是钙盐沉积于动脉管壁的过程,它可以导致动脉管壁变硬,顺应性降低,在临床上常见于动脉粥样硬化,慢性肾病和糖尿病患者,严重危害人类的健康。

然而,由于对血管钙化的发生和发展机制缺乏深入的认识,目前临床上缺乏治疗血管钙化的有效方法。因此,研究血管钙化的病因和发生发展的病理机制,阐明调节血管钙化的分子机制非常重要。近些年来的大量研究发现:血管钙化的过程类似于骨的生成,同样,也是一种受基因表达调控的,主动的过程。

血管钙化的主要细胞来源是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）。在损伤因素如钙磷代谢紊乱、氧化应激的刺激下,血管平滑肌细胞可从正常的收缩表型转换为成骨样表型并分泌大量的骨相关蛋白:碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、同源盒基因（Msx2）、核心结合因子α1（cbfa1/Runx2）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）、成骨相关转录因子（Osterix）、骨钙素（OCN）等,从而促进细胞钙化。因此血管平滑肌细胞的成骨样分化过程与血管钙化的有着密不可分的关系。大量研究已证实了钙磷代谢紊乱是导致血管平滑肌细胞钙化和凋亡的主要因素之一。

采用体外血管钙化模型,采用高钙高磷处理体外培养的血管平滑肌细胞,诱导细胞钙化,并用姜黄素处理细胞,观察姜黄素对血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化的影响及其凋亡信号机制。

1、姜黄素是否抑制血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化。2、姜黄素是否抑制血管平滑肌细胞凋亡。3、姜黄素抑制血管平滑肌细胞钙化的凋亡信号通路是否与JNK/Bax信号通路有关。

方法：本研究采用10m M BGP和3m M氯化钙处理血管平滑肌细胞3天和10天后,用茜素红染色测细胞钙化,邻甲酚酞络合剂法测钙离子浓度,检测ALP活性。用q PCR检测血管平滑肌细胞成骨样分化的相关分子和凋亡基因的表达水平。用Western blot检测JNK/Bax的表达水平。用流式细胞技术和Caspase3活性检测的方法检测了血管平滑肌细胞凋亡。

结果：姜黄素可抑制高钙高磷诱导的血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化,同时可抑制血管平滑肌细胞凋亡。另外,姜黄素可下调p-JNK、Bax的表达水平。抑制JNK信号能明显阻断血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化。

结论：姜黄素抑制了血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化,其机制很可能与JNK/Bax凋亡信号有关。

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