一、背景
弓形杆菌属通用PCR试剂盒采用SYBR Green染料法实时荧光PCR技术，针对弓形杆菌属的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光PCR技术对弓形杆菌属的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含弓形杆菌属核酸模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
二、弓形杆菌属通用PCR试剂盒产品及特点
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一、背景
弓形杆菌属通用PCR试剂盒采用SYBR Green染料法实时荧光PCR技术，针对弓形杆菌属的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光PCR技术对弓形杆菌属的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含弓形杆菌属核酸模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
二、弓形杆菌属通用PCR试剂盒产品及特点
实时荧光定量PCR技术（Arcobacter spp.PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针)，对PCR产物进行标记跟踪，随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化，并结合相应软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，从而计算待测样品中目的基因初始模版的量，常用于分析目的基因的表达水平的变化。它具有下列特点：
1、即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2、根据弓形杆菌属通用保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4、一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
5、弓形杆菌属通用PCR试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
三、应用
弓形杆菌属通用PCR试剂盒可以用于文蛤体内细菌的分离鉴定和群落结构分析：
通过纯培养方式对文蛤鳃组织内共生细菌进行了分离、筛选与鉴定,在此基础上对内共生细菌的种类和数量进行了统计和分析。
通过16S r RNA扩增子测序方法,对处于不同健康状态的文蛤鳃及肝胰腺组织的细菌群落结构组成进行了分析,发现文蛤的细菌种群丰度在不同的健康状态下及不同的组织中均有变化,同时发现了不同健康状态下文蛤肝胰腺组织中具有显著性差异的细菌类群。
此外,利用前期筛选到的潜在致病菌弓形杆菌MP43对文蛤进行了攻毒实验,评估了对文蛤可能的致病能力及其对免疫的影响。
主要结果如下：
1、通过采用纯培养方式,对文蛤鳃组织内共生细菌进行了多批次的分离与筛选。对得到的纯培养细菌进行了16S r RNA基因序列测序及比对分析,共得到了变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)等6个纲、13个目、23个科、47个属的215株细菌。分离细菌较多的属级类群有交替单胞菌属(Alternomonas)、Nautella属、葡萄球菌属(Staphylococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas),分别分离到20株、18株、15株以及13株细菌。该研究统计了纯培养方式鉴定得到的文蛤鳃组织中内共生微生物的种类及数量,为后续对文蛤内共生菌群的深入探究提供了参考。
2、采用16S rRNA扩增子测序,对处于不同健康状态的文蛤鳃及肝胰腺组织的细菌群落结构进行了分析。对得到的OTU数据进行聚类分析和物种注释,结果显示文蛤体内的细菌组成在不同的健康状态以及不同的组织中均有差异。健康状态的文蛤鳃及肝胰腺组织中,变形菌门均为丰度最高的类群,肝胰腺中放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的丰度明显高于鳃组织;在属级单元,文蛤鳃组织中细菌丰度最高的类群为弓形杆菌属(Arcobacter),而肝胰腺中丰度最高的属级类群为红球菌属(Rhodococcus)。发病状态的文蛤鳃组织中的细菌种类在门级单元上远少于肝胰腺组织,在属级单元上鳃组织中Endozoicomonas属占据着极高的丰度,而肝胰腺中丰度最高的类群为不动杆菌属(Acinetobacter)。对两种不同健康状态下的文蛤进行比较,肝胰腺中细菌组成的Alpha多样性和Beta多样性均无显著性差异,但进一步分析发现两组样品中有4个具有显著性差异的细菌类群,可作为文蛤健康状态指示的微生物参考指标。
3、不同温度条件下利用不同浓度的MP43对文蛤的人工感染实验结果表明,致死率与对照组之间均无显著差异,显示该菌株对文蛤不具有直接致病性;通过对攻毒后文蛤肝胰腺组织进行免疫相关基因的表达分析,显示文蛤的免疫系统对于MP43菌株未产生明显响应,肝胰腺弧菌载菌量也未呈现显著变化。