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将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)人小细胞肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02TA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37培养箱中消化1-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)人小细胞肺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人小细胞肺癌细胞可以用于CDK4/6抑制剂palbociclib在小细胞肺癌细胞系中的抗肿瘤作用及机制研究：
小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占肺癌总数的15%-20%,死亡率极高,5年生存率小于2%。大部分患者在确诊时已处于广泛期,而对于广泛期小细胞肺癌患者来讲,化疗是其最主要的治疗方式,但在治疗过程中,小细胞肺癌对化疗药物普遍出现耐药,肿瘤复发是不可避免的,因此,新型药物的研发至关重要。近年来,靶向治疗在非小细胞肺癌患者的治疗中越来越受欢迎,但在小细胞肺癌患者中的治疗还处于试验阶段,目前尚未发现可以应用于小细胞肺癌患者的靶向治疗药物。
CDK4/6抑制剂是一种靶向治疗药物,目前是临床研究的重点。CDK4/6抑制剂可以使细胞周期停滞在G1期,促进细胞凋亡,达到抗肿瘤的目的。Palbociclib是首个应用于临床的CDK4/6抑制剂,具有抗肿瘤作用,该药物已被FDA批准用于绝经后的雌激素受体阳性乳腺癌患者。但palbociclib在小细胞肺癌患者中是否具有抗肿瘤作用及其潜在的作用机制尚未有研究阐述。
因此,本研究以小细胞肺癌细胞系DMS114、H1688细胞作为研究对象,探究了CDK4/6抑制剂palbociclib对小细胞肺癌细胞生物学行为的影响及其潜在的作用机制。
研究方法：
1、通过MTT、克隆形成实验、流式细胞术探究palbociclib对小细胞肺癌细胞凋亡、增殖的影响。2通过GEO数据库分析CDK4、CDK6、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、结节性硬化症蛋白复合体2(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)在小细胞肺癌患者中的表达情况。3通过qRT-PCR、western blotting实验检测palbociclib对小细胞肺癌细胞中mTOR、TSC2的mRNA以及蛋白表达水平的影响。研究结果:1 Palbociclib可以抑制小细胞肺癌细胞的增殖,促进其凋亡。
2、通过对GEO数据库中的GSE43346数据集分析发现,与正常人相比,小细胞肺癌患者中的CDK4、m TOR呈高表达,CDK6、TSC2呈低表达。
3、Palbociclib可以降低mTOR的mRNA和蛋白的表达水平,升高TSC2的mRNA与蛋白的表达水平。
4、Palbociclib通过下调mTOR对小细胞肺癌细胞系发挥抗肿瘤作用。
研究结论：总的来说,palbociclib通过下调mTOR促进小细胞肺癌细胞凋亡,抑制小细胞肺癌细胞增殖,进而达到抗肿瘤作用。这表明palbociclib可能是小细胞肺癌患者的潜在治疗药物。