一、背景
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒是一种经典的细胞凋亡检测方法。这种试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）双染的方法，可以快速简便地检测细胞凋亡。
二、细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒操作步骤
1、细胞样品的制备：
贴壁细胞：
小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并
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一、背景
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒是一种经典的细胞凋亡检测方法。这种试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）双染的方法，可以快速简便地检测细胞凋亡。
二、细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒操作步骤
1、细胞样品的制备：
贴壁细胞：
小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并
轻轻吹散细胞。
收集上述细胞悬液到离心管内，41000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，41000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
悬浮细胞：
41000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，41000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2、配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4保存备用。
3、重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×106细胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
4、Hoechst 33258/PI染色：
一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，轻轻混匀，置于冰浴或4，孵育20～30min。
两步法：
加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37水浴，孵育5～15 min
置于冰水中冷却后，41000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。
加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
加入5μl PI Stain，置于冰浴或4，孵育20～30min。
5、细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前41000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细胞呈低蓝光/高红光。
三、应用
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒可以用于甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的研究：
甘草素抑制肿瘤细胞生长及诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究目的:探讨甘草素(liquiritigenin)对两株肿瘤细胞生长的抑制作用及对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用的影响。
方法：本研究采用体外培养人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的方法,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察甘草素对肿瘤细胞增殖的影响;Hoechst染色法和电镜观察甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡的形态变化;流式细胞仪检测甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡率的变化情况。
结果：甘草素对Lovo结肠癌细胞作用24、48和72h时各剂量组出现生长抑制作用,其最高抑制率分别为15.4%、57.1%和84.7%;对SMMC-7721肝癌细胞作用24、48和72h时,各剂量组都已出现生长抑制作用,最高抑制率分别达到85.6%、94.2%和91.3%,并呈现明显的剂量-效应关系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721细胞12、24、48和72h,Hoechst染色观察可见细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;透射电镜观察可见0.4mM甘草素作用细胞72h后,细胞染色质浓缩、空泡。流式细胞仪检测结果发现,甘草素可诱导SMMC-7721细胞凋亡,并呈时间-剂量效应关系,甘草素剂量为0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的细胞发生凋亡。
结论：甘草素对人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的生长均有抑制作用,其中对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用更加明显,并能诱导SMMC-7721肝癌细胞细胞凋亡。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
收集上述细胞悬液到离心管内，41000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，41000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
悬浮细胞：
41000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，41000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2、配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4保存备用。
3、重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×106细胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
4、Hoechst 33258/PI染色：
一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，轻轻混匀，置于冰浴或4，孵育20～30min。
两步法：
加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37水浴，孵育5～15 min
置于冰水中冷却后，41000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。
加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
加入5μl PI Stain，置于冰浴或4，孵育20～30min。
5、细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前41000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细胞呈低蓝光/高红光。
三、应用
细胞凋亡-HOECHST染色试剂盒可以用于甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的研究：
甘草素抑制肿瘤细胞生长及诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究目的:探讨甘草素(liquiritigenin)对两株肿瘤细胞生长的抑制作用及对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用的影响。
方法：本研究采用体外培养人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的方法,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察甘草素对肿瘤细胞增殖的影响;Hoechst染色法和电镜观察甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡的形态变化;流式细胞仪检测甘草素诱导SMMC-7721细胞凋亡率的变化情况。
结果：甘草素对Lovo结肠癌细胞作用24、48和72h时各剂量组出现生长抑制作用,其最高抑制率分别为15.4%、57.1%和84.7%;对SMMC-7721肝癌细胞作用24、48和72h时,各剂量组都已出现生长抑制作用,最高抑制率分别达到85.6%、94.2%和91.3%,并呈现明显的剂量-效应关系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721细胞12、24、48和72h,Hoechst染色观察可见细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;透射电镜观察可见0.4mM甘草素作用细胞72h后,细胞染色质浓缩、空泡。流式细胞仪检测结果发现,甘草素可诱导SMMC-7721细胞凋亡,并呈时间-剂量效应关系,甘草素剂量为0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的细胞发生凋亡。
结论：甘草素对人结肠癌Lovo细胞和人肝癌SMMC-7721细胞的生长均有抑制作用,其中对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用更加明显,并能诱导SMMC-7721肝癌细胞细胞凋亡。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！