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培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备MEM培养基；北美胎牛血清，10%；PS 1%。
2）人胚肺成纤维细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人胚肺成纤维细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
2、人胚肺成纤维细胞处理：
1）复苏人胚肺成纤维细胞：将含有1mL人胚肺成纤维细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查人胚肺成纤维细胞密度。
2）人胚肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
3）人胚肺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
对于人胚肺成纤维细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人胚肺成纤维细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2ml完全培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。
4、将人胚肺成纤维细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
下面以T25瓶为例；
1、人胚肺成纤维细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮人胚肺成纤维细胞，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。
3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人胚肺成纤维细胞可以用于P物质对人胚肺成纤维细胞作用及其机制的研究：
探讨P物质(Substance P,SP)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖与活化的作用及其调控机制,进一步揭示P物质参与肺间质纤维化中的作用机理,为临床治疗肺间质纤维化的药物研究与开发提供新的思路。
方法：
体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),取对数生长期的细胞为研究对象,展开以下研究:
(1)以系列浓度(1、10、100、1000、10000 n M)的P物质处理MRC-5细胞,利用CCK8法检测系列浓度的P物质在不同时间点(24、48、72h)对MRC-5增殖活性影响。从而筛选出P物质对MRC-5细胞的作用浓度及时间。
(2)利用天狼猩红染色检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞分泌胶原纤维含量变化。
(3)使用Western blot检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞对α-SMA蛋白表达的影响。
(4)在此基础上,我们将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组(简称P物质组)、100 n M P物质+10μM L732138组(NK-1R抑制剂)(以下简称P物质+L732138组),将以上三组细胞培养72h后,分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化,利用Western blot检测各组细胞α-SMA蛋白表达的变化,从而阐明P物质对MRC-5细胞的增殖及活化作用。
(5)为研究P物质对MRC-5细胞的作用机制,将对照组、P物质组、P物质+L732138组三组细胞体外培养72h,利用Western blot检测各组细胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表达变化。
(6)为进一步检测SP/NK-1R在TGF-β1/Smad3信号通路中的作用,我们再次将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组(简称P物质组),100 n M P物质+10μM SB431542组(TGFβR1抑制剂)(以下简称P物质+SB431542组),分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化。
结果：
(1)MRC-5细胞经系列浓度(1、10、100、1000、10000 n M)P物质处理后,24 h后OD值无明显变化;与对照组比较,在处理48h及72h后,100n M P物质组细胞OD值均升高,其中以72h时OD值升高更为明显(P<0.01)。
(2)MRC-5细胞经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,100 n M P物质组处理的细胞胶原纤维含量明显增多(P<0.001)。
(3)经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,10 n M P物质组及100 n M P物质组细胞α-SMA蛋白相对表达水平均增高,其中以100 n M P物质组增高更为显著(P<0.001)。
(4)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+L732138组细胞胶原纤维含量显著减少(P<0.001)、细胞OD值及α-SMA蛋白相对表达量均明显降低(P<0.01)。
(5)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+L732138组细胞TGFβ1、p-Smad3蛋白相对表达量均明显降低(P<0.01)。
(6)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+SB431542组细胞OD值、胶原纤维含量均明显降低(P<0.001)。
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备MEM培养基；北美胎牛血清，10%；PS 1%。
2）人胚肺成纤维细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人胚肺成纤维细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
2、人胚肺成纤维细胞处理：
1）复苏人胚肺成纤维细胞：将含有1mL人胚肺成纤维细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查人胚肺成纤维细胞密度。
2）人胚肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
3）人胚肺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
对于人胚肺成纤维细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人胚肺成纤维细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2ml完全培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。
4、将人胚肺成纤维细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
下面以T25瓶为例；
1、人胚肺成纤维细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮人胚肺成纤维细胞，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。
3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人胚肺成纤维细胞可以用于P物质对人胚肺成纤维细胞作用及其机制的研究：
探讨P物质(Substance P,SP)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖与活化的作用及其调控机制,进一步揭示P物质参与肺间质纤维化中的作用机理,为临床治疗肺间质纤维化的药物研究与开发提供新的思路。
方法：
体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),取对数生长期的细胞为研究对象,展开以下研究:
(1)以系列浓度(1、10、100、1000、10000 n M)的P物质处理MRC-5细胞,利用CCK8法检测系列浓度的P物质在不同时间点(24、48、72h)对MRC-5增殖活性影响。从而筛选出P物质对MRC-5细胞的作用浓度及时间。
(2)利用天狼猩红染色检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞分泌胶原纤维含量变化。
(3)使用Western blot检测系列浓度的P物质在72h时MRC-5细胞对α-SMA蛋白表达的影响。
(4)在此基础上,我们将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组(简称P物质组)、100 n M P物质+10μM L732138组(NK-1R抑制剂)(以下简称P物质+L732138组),将以上三组细胞培养72h后,分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化,利用Western blot检测各组细胞α-SMA蛋白表达的变化,从而阐明P物质对MRC-5细胞的增殖及活化作用。
(5)为研究P物质对MRC-5细胞的作用机制,将对照组、P物质组、P物质+L732138组三组细胞体外培养72h,利用Western blot检测各组细胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表达变化。
(6)为进一步检测SP/NK-1R在TGF-β1/Smad3信号通路中的作用,我们再次将细胞分为三个组,分别是对照组、100 n M P物质组(简称P物质组),100 n M P物质+10μM SB431542组(TGFβR1抑制剂)(以下简称P物质+SB431542组),分别以CCK8法检测各组细胞增殖活性,用天狼猩红染色检测各组细胞分泌胶原纤维的含量变化。
结果：
(1)MRC-5细胞经系列浓度(1、10、100、1000、10000 n M)P物质处理后,24 h后OD值无明显变化;与对照组比较,在处理48h及72h后,100n M P物质组细胞OD值均升高,其中以72h时OD值升高更为明显(P<0.01)。
(2)MRC-5细胞经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,100 n M P物质组处理的细胞胶原纤维含量明显增多(P<0.001)。
(3)经系列浓度P物质处理72 h后,与对照组比较,10 n M P物质组及100 n M P物质组细胞α-SMA蛋白相对表达水平均增高,其中以100 n M P物质组增高更为显著(P<0.001)。
(4)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+L732138组细胞胶原纤维含量显著减少(P<0.001)、细胞OD值及α-SMA蛋白相对表达量均明显降低(P<0.01)。
(5)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+L732138组细胞TGFβ1、p-Smad3蛋白相对表达量均明显降低(P<0.01)。
(6)细胞经药物处理72h后,与P物质组比较,P物质+SB431542组细胞OD值、胶原纤维含量均明显降低(P<0.001)。