实验室RIPA裂解液的知识与应用及相关研究！
2024-11-15 15:40阅读：
实验室RIPA裂解液的知识与应用及相关研究！
一、背景
RIPA裂解液即放射免疫沉淀法裂解缓冲液，是一种传统的可用于裂解细胞或组织的快速裂解液。其主要原理是利用表面活性剂等成分裂解细胞膜（包括核膜），从组织或细胞中抽取可溶性蛋白。
RIPA裂解液主要用于从动物组织和哺乳动物细胞中抽取可溶性蛋白，可适用于裂解贴壁细胞和悬浮细胞。其裂解后得到的蛋白一般可直接用于常规的WB（Western
Blot，蛋白质印迹法）、IP（免疫沉淀）以及co-IP（免疫共沉淀）等实验。
RIPA裂解液的配制方法多样，主要包括裂解成分、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂三种组分。裂解成分能破坏细胞膜和蛋白间的相互作用，从而裂解组织或细胞；蛋白酶抑制剂可有效抑制各类蛋白酶的活性，防止蛋白过度降解；磷酸酶抑制剂则能抑制去磷酸化作。
在使用RIPA裂解液时，为防止蛋白
降解，所有的操作应尽量在冰上进行。同时，建议向溶液中加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂。此外，根据具体的实验需求，若需获得更高浓度的蛋白，应适当减少哺乳动物蛋白抽提试剂的使用量。
值得注意的是，由于RIPA裂解液中含有一些稳定性相对较弱的酶类抑制剂，如PMSF，其稳定性极弱，半衰期只有0.5小时，因此必须现配现用，且通常应保存在-20的环境中。
RIPA裂解液是一种强大的实验工具，用于提取和分析细胞和组织中的蛋白。但请注意，其仅可用于科研实验，严禁用于其他非科研用途。同时，为确保实验的准确性和可靠性，请严格遵循相关操作规程和安全要求。
二、应用
RIPA裂解液可以用于IL-37d通过抑制可溶性ST2的表达维持白色脂肪组织中的免疫稳态、控制肥胖：
研究中发现IL-37d在人脂肪组织和脂肪组织衍生的干细胞(ADSC)中的特异性表达;IL-37d转基因小鼠抵抗高脂诱导的肥胖及提高胰岛素敏感性;机制探索初步发现IL-37d可抵抗高脂导致的WAT中ST2+细胞的降低,提示IL-37d可能通过上调IL-33/ST2介导的型免疫反应,维持脂肪的免疫平衡控制肥胖。
利用IL-37d转基因小鼠、IL-37d&IL-33ko基因小鼠,建立高脂饮食诱导的肥胖模型,进一步确定:一、IL-37d通过调控IL-33/ST2促进小鼠脂肪组织型免疫反应;二、IL-37d调控IL-33/ST2的分子机制。
研究方法：
1、构建IL-37d&IL-33ko基因小鼠由公司制作的IL-37d转基因小鼠与IL-33ko基因敲除鼠进行杂交,通过PCR与DNA琼脂糖电泳结合基因测序验证得到IL-37d&IL-33ko基因小鼠。
2、IL-37d对高脂诱导的可溶性ST2的抑制取高脂诱导的WT或IL-37d转基因小鼠的皮下脂肪与附睾脂肪组织,用Trizol试剂提取脂肪组织RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录为DNA,用实时荧光定量PCR法检测可溶性ST2的mRNA水平;将皮下脂肪与附睾脂肪组织体外培养24小时取培养上清用ELISA法检测上清中可溶性ST2的含量。
3、IL-37d对TNF-α诱导的可溶性ST2的抑制取WT或IL-37d转基因鼠来源的皮下脂肪,提取皮下脂肪组织来源的间充质干细胞(S-ADSC),使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS对照刺激24小时,提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录为DNA,用实时荧光定量PCR法检测可溶性ST2的mRNA水平;取细胞培养上清,用ELISA法检测上清中可溶性ST2的含量。
4、IL-37d对通过抑制NF-κB途径抑制可溶性ST2取高脂诱导的WT或IL-37d转基因小鼠的皮下脂肪与附睾脂肪组织,用Trizol试剂及RIPA裂解液提取脂肪组织RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录为DNA,用实时荧光定量PCR法检测NF-κB途径调控的IL-6,IL-1β和TNF-α的mRNA水平;用RIPA裂解液将皮下脂肪与附睾脂肪组织裂解,高速离心后提取蛋白,用western
blot检测P65磷酸化水平。
5、IL-37d对通过与受体IL-1R8结合抑制NF-κB途径取IL-37d转基因小鼠的皮下脂肪,提取皮下脂肪组织来源的间充质干细胞(S-ADSC),用小干扰RNA干扰IL-1R8,使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS对照刺激24小时,提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录为DNA,用实时荧光定量PCR法检测可溶性ST2的mRNA水平;用RIPA裂解液将皮下脂肪与附睾脂肪组织裂解,高速离心后提取蛋白,用western
blot检测P65磷酸化水平。
结果：用RIPA裂解液将皮下脂肪与附睾脂肪组织裂解,高速离心后提取蛋白,用western
blot检测P65磷酸化水平,发现高脂显著增加P65磷酸化水平,而IL-37d转基因小鼠的脂肪组织P65磷酸化水平低于野生型小鼠,以上结果证明IL-37d可抑制NF-κB途径,进而抑制sST2。5.IL-37d对通过与受体IL-1R8结合抑制NF-κB途径取IL-37d转基因小鼠的皮下脂肪,提取皮下脂肪组织来源的间充质干细胞(S-ADSC),用小干扰RNA干扰IL-1R8,使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS对照刺激24小时,提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录为DNA,用实时荧光定量PCR法检测sST2的mRNA水平,发现干扰IL-1R8可以逆转IL-37d对sST2的抑制;用RIPA裂解液将皮下脂肪与附睾脂肪组织裂解,高速离心后提取蛋白,用western
blot检测P65磷酸化水平,发现干扰IL-1R8同样逆转了IL-37d对P65磷酸化水平的抑制。
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