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、肠球菌（如粪肠球菌）、产气荚膜梭菌孢子等。
意义：高数量通常指示卫生条件差、可能存在粪便污染、处理/消毒不彻底，从而提示存在病原体（如沙门氏菌、志贺氏菌、病毒、寄生虫）的风险较高。它们更容易、更快速、更安全地被检测。
2、指标菌：
定义：特指那些直接与特定病原体相关联，其存在明确指示该病原体可能存在的微生物。有时与“指示菌”混用，但更强调与病原体的直接联系。
代表：
大肠杆菌 (Escherichia coli)：常被视为粪便污染最特异的指标菌（属于粪大肠菌群）。其存在强烈提示近期粪便污染和存在肠道病原体的风险。
肠道病毒：可作为人类肠道病毒污染的指标。
特定基因标记：分子生物学方法检测的特定遗传标记，能更特异地指示人类粪便污染源。
意义：提供比一般指示菌更具体、更直接的污染来源和风险信息。
二、常用检测与计数方法
检测和计数通常遵循标准方法（《水和废水标准检验方法》、ISO标准、FDA《细菌学分析手册》、国家标准如GB系列等）。主要分为培养法、酶底物法、分子生物学方法和快速检测法。
1、培养法 (最常用，是金标准或参考方法)
原理：利用目标菌的生理生化特性（如发酵乳糖产酸产气、耐热性、特定酶活性），在选择性培养基上生长形成可见菌落或引起培养基颜色/状态变化。
主要计数方法：
a.多管发酵法：
原理：将样品进行一系列稀释，每个稀释度接种多管（通常5管或10管）含选择性液体培养基的试管中。
过程：根据目标菌特性进行初发酵（产酸产气）、复发酵确认、完成鉴定试验。
计数：根据统计学原理（MPN表），统计阳性管数（产酸产气的管数），查最可能数表得到样品的MPN值（Most Probable Number，最可能数/100mL或g）。单位通常是MPN/100mL或MPN/g。
优点：适用于浊度高、含颗粒物或菌量较低的样品（如水、淤泥、某些食品）。灵敏度相对较高。
缺点：耗时长（通常24-72小时甚至更长）、工作量大、耗费材料多、结果是统计学估计值而非精确计数。
应用：总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌的检测计数。
b.滤膜法：
原理：将一定体积的样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被截留在膜表面。将滤膜贴在选择性固体培养基上培养。
计数：培养后，直接计数滤膜上生长的具有目标菌特征形态（如金属光泽）的菌落数。
计算：菌落数 / 过滤样品体积 = CFU (Colony Forming Units, 菌落形成单位) / 100mL 或 /g。
优点：结果直接（CFU）、相对快速（通常24-48小时）、可处理较大体积样品提高灵敏度、节省培养基。
缺点：不适用于浑浊度高、含大量悬浮物或杂菌过多的样品（会堵塞滤膜或干扰计数）。需要无菌操作和过滤装置。
应用：清洁水体（如饮用水、地表水、游泳池水）中的总大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌的检测计数。
c.平板涂布/倾注法：
原理：将样品或稀释液涂布在选择性固体培养基表面，或与熔化的培养基混合倾注平板。
计数：培养后，计数平板上具有目标菌特征形态的菌落。
计算：菌落数 × 稀释倍数 / 接种体积 = CFU / mL 或 /g。
优点：操作相对简单，结果直观（CFU）。
缺点：通常适用于菌量适中且杂质较少的样品（如食品匀浆液）。灵敏度受接种体积限制（通常≤1mL）。
应用：食品、土壤等样品中肠球菌、产气荚膜梭菌等的计数；也用于大肠菌群/大肠杆菌的确认试验。
2、酶底物法 (Defined Substrate Technology - DST)
原理：利用目标菌特有的酶（如大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶分解MUG产生荧光；总大肠菌群的β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养基变黄）来检测。底物与营养物质结合在单一培养基或试剂中。
代表方法：
Colilert® / Quanti-Tray® 系统：
将样品加入含特定酶底物的试剂中。
混合溶解后，倒入特制的多孔定量盘中，密封培养。
计数：
总大肠菌群阳性孔：孔内液体变黄（产β-半乳糖苷酶）。
大肠杆菌阳性孔：孔内液体在紫外灯下显荧光（产β-葡萄糖醛酸酶）。
根据阳性孔的数量查专用的MPN表得到结果（MPN/100mL）。
优点：非常快速（通常18-24小时出结果）、操作简便（只需加样、溶解、倒入定量盘）、特异性好（尤其区分大肠杆菌）、结果判读客观（颜色/荧光）、可同时检测总大肠菌群和大肠杆菌。
缺点：成本相对较高（试剂和定量盘），定量盘需要专用封口设备，通常适用于液体样品（水）。
应用：水质（特别是饮用水和娱乐用水）中总大肠菌群和大肠杆菌的快速检测计数（MPN）。类似原理也用于肠球菌检测。
3、分子生物学方法 (快速、高特异性和灵敏度)
原理：检测目标菌的特异性基因片段（DNA或RNA）。
主要技术：
PCR (聚合酶链式反应)：定性检测目标菌是否存在。也可结合凝胶电泳或探针杂交。
qPCR/实时荧光定量PCR：最重要和最常用的定量分子方法。在PCR反应体系中加入荧光标记探针或染料，实时监测扩增产物量，通过标准曲线精确定量目标基因的拷贝数。结果通常报告为基因拷贝数 (Gene Copies, GC) / 体积或重量。需要将GC转换为细胞数（通常假设1个细胞含1个靶基因拷贝，但实际有差异）。
数字PCR：更精确的绝对定量方法，无需标准曲线，直接将反应体系分割成数万个微反应单元进行PCR，统计阳性单元比例计算绝对拷贝数。精度更高，抗抑制剂能力强，但成本高、通量相对较低。
测序 (如16S rRNA基因测序、宏基因组测序)：用于复杂微生物群落中指示/指标菌的鉴定和相对丰度分析，但通常不用于日常定量检测。
优点：极快（几小时出结果）、特异性极高（可区分到种甚至亚种/血清型）、灵敏度极高（可检测不可培养或受损的细菌）、可自动化高通量检测。
缺点：成本高（仪器、试剂）、需要专业人员和实验室、无法区分死菌和活菌（除非结合前处理如PMA/EMA染料或mRNA检测）、样品中抑制物可能干扰反应、结果单位（GC）与传统的CFU/MPN意义不同，需要建立相关性。
应用：水质、食品中特定指示菌（如大肠杆菌、肠球菌）和指标菌的快速筛查和高通量定量检测；病原体的直接检测。
4、快速检测试剂盒/测试片
原理：基于显色培养基、免疫学方法（如胶体金侧流层析）或简易酶底物原理的预包装一次性装置。
代表：3M Petrifilm™测试片（大肠菌群、大肠杆菌）、显色培养基平板、一些免疫层析试纸条。
优点：操作极其简便、快速（通常24-48小时）、便携（部分可用于现场）、结果直观（颜色变化或菌落显色）。
缺点：通常为半定量（如按菌落密度分级）或定性，精确度可能低于标准方法，成本可能较高。
应用：食品加工环境监控、现场快速筛查、中小实验室的日常检测。
三、方法选择的关键考虑因素
目标微生物：总大肠菌群？大肠杆菌？肠球菌？指标菌需要更高特异性的方法（如酶底物法、分子法）。
样品类型：水？食品？土壤？浊度？含颗粒物？含抑制剂？决定能否用滤膜法、是否需要特殊前处理。
所需信息：定性（有/无）？定量（CFU/MPN/GC）？精确度要求？
时间和速度要求：常规监测可用培养法；需要快速结果（如疫情调查、过程控制）选酶底物法或分子法。
成本和资源：实验室设备、人员技能、预算。分子法设备投入大，酶底物法试剂成本高，培养法耗时长但设备要求相对低。
法规和标准要求：特定领域（如饮用水、食品出口）往往规定必须使用的标准方法。结果需有可比性。
死菌 vs 活菌：培养法和酶底物法（基于酶活性）主要检测活菌；分子法（PCR）检测DNA，无法区分死菌活菌，可能高估风险。
四、总结
指示菌和指标菌的检测与计数是保障公共卫生和环境安全的关键。选择合适的方法需要权衡目标微生物、样品特性、信息需求、速度、成本和法规要求。传统培养法（MPN法、滤膜法、平板法）仍是基础标准和参考方法。酶底物法因其快速、简便和特异性在特定领域（尤其水质）广泛应用。分子生物学方法（特别是qPCR）凭借其超快速度和超高特异性/灵敏度发展迅速，是未来的重要方向，但成本和对死菌的检测是其局限性。快速检测试剂盒/测试片则提供了便捷的现场或筛查选择。理解各种方法的原理、优缺点和适用范围对于准确评估微生物风险和做出正确决策至关重要。
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意义：高数量通常指示卫生条件差、可能存在粪便污染、处理/消毒不彻底，从而提示存在病原体（如沙门氏菌、志贺氏菌、病毒、寄生虫）的风险较高。它们更容易、更快速、更安全地被检测。
2、指标菌：
定义：特指那些直接与特定病原体相关联，其存在明确指示该病原体可能存在的微生物。有时与“指示菌”混用，但更强调与病原体的直接联系。
代表：
大肠杆菌 (Escherichia coli)：常被视为粪便污染最特异的指标菌（属于粪大肠菌群）。其存在强烈提示近期粪便污染和存在肠道病原体的风险。
肠道病毒：可作为人类肠道病毒污染的指标。
特定基因标记：分子生物学方法检测的特定遗传标记，能更特异地指示人类粪便污染源。
意义：提供比一般指示菌更具体、更直接的污染来源和风险信息。
二、常用检测与计数方法
检测和计数通常遵循标准方法（《水和废水标准检验方法》、ISO标准、FDA《细菌学分析手册》、国家标准如GB系列等）。主要分为培养法、酶底物法、分子生物学方法和快速检测法。
1、培养法 (最常用，是金标准或参考方法)
原理：利用目标菌的生理生化特性（如发酵乳糖产酸产气、耐热性、特定酶活性），在选择性培养基上生长形成可见菌落或引起培养基颜色/状态变化。
主要计数方法：
a.多管发酵法：
原理：将样品进行一系列稀释，每个稀释度接种多管（通常5管或10管）含选择性液体培养基的试管中。
过程：根据目标菌特性进行初发酵（产酸产气）、复发酵确认、完成鉴定试验。
计数：根据统计学原理（MPN表），统计阳性管数（产酸产气的管数），查最可能数表得到样品的MPN值（Most Probable Number，最可能数/100mL或g）。单位通常是MPN/100mL或MPN/g。
优点：适用于浊度高、含颗粒物或菌量较低的样品（如水、淤泥、某些食品）。灵敏度相对较高。
缺点：耗时长（通常24-72小时甚至更长）、工作量大、耗费材料多、结果是统计学估计值而非精确计数。
应用：总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌的检测计数。
b.滤膜法：
原理：将一定体积的样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被截留在膜表面。将滤膜贴在选择性固体培养基上培养。
计数：培养后，直接计数滤膜上生长的具有目标菌特征形态（如金属光泽）的菌落数。
计算：菌落数 / 过滤样品体积 = CFU (Colony Forming Units, 菌落形成单位) / 100mL 或 /g。
优点：结果直接（CFU）、相对快速（通常24-48小时）、可处理较大体积样品提高灵敏度、节省培养基。
缺点：不适用于浑浊度高、含大量悬浮物或杂菌过多的样品（会堵塞滤膜或干扰计数）。需要无菌操作和过滤装置。
应用：清洁水体（如饮用水、地表水、游泳池水）中的总大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌的检测计数。
c.平板涂布/倾注法：
原理：将样品或稀释液涂布在选择性固体培养基表面，或与熔化的培养基混合倾注平板。
计数：培养后，计数平板上具有目标菌特征形态的菌落。
计算：菌落数 × 稀释倍数 / 接种体积 = CFU / mL 或 /g。
优点：操作相对简单，结果直观（CFU）。
缺点：通常适用于菌量适中且杂质较少的样品（如食品匀浆液）。灵敏度受接种体积限制（通常≤1mL）。
应用：食品、土壤等样品中肠球菌、产气荚膜梭菌等的计数；也用于大肠菌群/大肠杆菌的确认试验。
2、酶底物法 (Defined Substrate Technology - DST)
原理：利用目标菌特有的酶（如大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶分解MUG产生荧光；总大肠菌群的β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养基变黄）来检测。底物与营养物质结合在单一培养基或试剂中。
代表方法：
Colilert® / Quanti-Tray® 系统：
将样品加入含特定酶底物的试剂中。
混合溶解后，倒入特制的多孔定量盘中，密封培养。
计数：
总大肠菌群阳性孔：孔内液体变黄（产β-半乳糖苷酶）。
大肠杆菌阳性孔：孔内液体在紫外灯下显荧光（产β-葡萄糖醛酸酶）。
根据阳性孔的数量查专用的MPN表得到结果（MPN/100mL）。
优点：非常快速（通常18-24小时出结果）、操作简便（只需加样、溶解、倒入定量盘）、特异性好（尤其区分大肠杆菌）、结果判读客观（颜色/荧光）、可同时检测总大肠菌群和大肠杆菌。
缺点：成本相对较高（试剂和定量盘），定量盘需要专用封口设备，通常适用于液体样品（水）。
应用：水质（特别是饮用水和娱乐用水）中总大肠菌群和大肠杆菌的快速检测计数（MPN）。类似原理也用于肠球菌检测。
3、分子生物学方法 (快速、高特异性和灵敏度)
原理：检测目标菌的特异性基因片段（DNA或RNA）。
主要技术：
PCR (聚合酶链式反应)：定性检测目标菌是否存在。也可结合凝胶电泳或探针杂交。
qPCR/实时荧光定量PCR：最重要和最常用的定量分子方法。在PCR反应体系中加入荧光标记探针或染料，实时监测扩增产物量，通过标准曲线精确定量目标基因的拷贝数。结果通常报告为基因拷贝数 (Gene Copies, GC) / 体积或重量。需要将GC转换为细胞数（通常假设1个细胞含1个靶基因拷贝，但实际有差异）。
数字PCR：更精确的绝对定量方法，无需标准曲线，直接将反应体系分割成数万个微反应单元进行PCR，统计阳性单元比例计算绝对拷贝数。精度更高，抗抑制剂能力强，但成本高、通量相对较低。
测序 (如16S rRNA基因测序、宏基因组测序)：用于复杂微生物群落中指示/指标菌的鉴定和相对丰度分析，但通常不用于日常定量检测。
优点：极快（几小时出结果）、特异性极高（可区分到种甚至亚种/血清型）、灵敏度极高（可检测不可培养或受损的细菌）、可自动化高通量检测。
缺点：成本高（仪器、试剂）、需要专业人员和实验室、无法区分死菌和活菌（除非结合前处理如PMA/EMA染料或mRNA检测）、样品中抑制物可能干扰反应、结果单位（GC）与传统的CFU/MPN意义不同，需要建立相关性。
应用：水质、食品中特定指示菌（如大肠杆菌、肠球菌）和指标菌的快速筛查和高通量定量检测；病原体的直接检测。
4、快速检测试剂盒/测试片
原理：基于显色培养基、免疫学方法（如胶体金侧流层析）或简易酶底物原理的预包装一次性装置。
代表：3M Petrifilm™测试片（大肠菌群、大肠杆菌）、显色培养基平板、一些免疫层析试纸条。
优点：操作极其简便、快速（通常24-48小时）、便携（部分可用于现场）、结果直观（颜色变化或菌落显色）。
缺点：通常为半定量（如按菌落密度分级）或定性，精确度可能低于标准方法，成本可能较高。
应用：食品加工环境监控、现场快速筛查、中小实验室的日常检测。
三、方法选择的关键考虑因素
目标微生物：总大肠菌群？大肠杆菌？肠球菌？指标菌需要更高特异性的方法（如酶底物法、分子法）。
样品类型：水？食品？土壤？浊度？含颗粒物？含抑制剂？决定能否用滤膜法、是否需要特殊前处理。
所需信息：定性（有/无）？定量（CFU/MPN/GC）？精确度要求？
时间和速度要求：常规监测可用培养法；需要快速结果（如疫情调查、过程控制）选酶底物法或分子法。
成本和资源：实验室设备、人员技能、预算。分子法设备投入大，酶底物法试剂成本高，培养法耗时长但设备要求相对低。
法规和标准要求：特定领域（如饮用水、食品出口）往往规定必须使用的标准方法。结果需有可比性。
死菌 vs 活菌：培养法和酶底物法（基于酶活性）主要检测活菌；分子法（PCR）检测DNA，无法区分死菌活菌，可能高估风险。
四、总结
指示菌和指标菌的检测与计数是保障公共卫生和环境安全的关键。选择合适的方法需要权衡目标微生物、样品特性、信息需求、速度、成本和法规要求。传统培养法（MPN法、滤膜法、平板法）仍是基础标准和参考方法。酶底物法因其快速、简便和特异性在特定领域（尤其水质）广泛应用。分子生物学方法（特别是qPCR）凭借其超快速度和超高特异性/灵敏度发展迅速，是未来的重要方向，但成本和对死菌的检测是其局限性。快速检测试剂盒/测试片则提供了便捷的现场或筛查选择。理解各种方法的原理、优缺点和适用范围对于准确评估微生物风险和做出正确决策至关重要。
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