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细菌芽胞染色的原理与常用方法及应用场景与结果判定!

2026-01-20 14:50阅读:
细菌芽胞染色的原理与常用方法及应用场景与结果判定!



百欧博伟生物:细菌的芽胞染色是微生物学中用于区分细菌营养体与芽胞的特殊染色技术,其核心原理是利用芽胞具有坚韧的芽孢壁(含大量肽聚糖和吡啶二羧酸钙,对染料亲和力低、抗渗透性强),需通过特殊处理(如加热)使染料进入芽胞,再经脱色步骤保留芽胞颜色,最终实现营养体与芽胞的颜色差异,便于显微镜观察。

一、染色原理

芽胞的结构特点决定了常规染色难以着色:

芽胞的抗染性:芽胞壁致密且含吡啶二羧酸钙,普通染料(如结晶紫、美蓝)无法直接穿透,需通过加热(或延长染色时间) 破坏芽胞壁的通透性,使染料(如孔雀绿)进入并与芽胞内物质结合。

脱色的选择性:染色后用蒸馏水(或自来水)脱色时,营养体的细胞壁通透性高,结合的染料易被洗脱;而芽胞内的染料与 DPA-Ca 等物质结合紧密,不易被脱色,仍保留原色(如孔雀绿的绿色)。

复染的对比性:最后用复染剂(如番红)对营养体进行染色,使其呈现与芽胞不同的颜色(如番红的红色),最终在显微镜下可清晰区分“绿色芽胞”与“红色营养体”。

二、常用染色方法

微生物实验室中最经典、最常用的是孔雀绿 - 番红染色法,操作步骤简单且效果稳定,具体流程如下:

步骤 操作细节 目的 时长/条件

涂片制备 取含芽胞的细菌培养物,在载玻片中央加 1 滴生理盐水,将菌苔研磨均匀,涂成薄而均匀的菌膜 保证细菌分散,避免重叠,便于观察 涂片后自然晾干

固定 将晾干的载玻片通过酒精灯外焰快速过 3 次 杀死细菌,使菌体黏附在载玻片上,防止染色时脱落 过焰时以载玻片不烫手为宜

初染 滴加孔雀绿染液覆盖整个菌膜,将载玻片置于石棉网上,用小火缓慢加热至染液微冒蒸汽,期间不断补充染液 加热破坏芽胞壁通透性,使孔雀绿进入芽胞并结合 维持微沸状态 5-10min

脱色 待载玻片冷却后,用蒸馏水缓慢冲洗至流出液无绿色 洗脱营养体上未结合的孔雀绿,保留芽胞内的绿色 冲洗至流出液澄清即可

复染 滴加番红染液覆盖菌膜,室温下静置 使脱色后的营养体着色,与芽胞形成颜色对比 3-5min

干燥与观察 倾去番红染液,用吸水纸轻轻吸干载玻片表面水分,置于光学显微镜下,用油镜观察 去除多余染液,清晰观察染色结果 油镜观察时需滴加香柏油

三、预期染色结果

通过孔雀绿 - 番红染色后,显微镜下可观察到两种不同颜色的结构,具体判断标准如下:

芽胞:呈绿色,形态多样(如圆形、椭圆形、圆柱形),位置可在菌体中央(如枯草芽孢杆菌)、末端(如破伤风梭菌,呈“鼓槌状”)或次末端;

营养体(未形成芽胞的细菌):呈红色,形态为细菌的典型形态(如枯草芽孢杆菌为杆状);

若细菌处于“芽胞形成过程中”,可能观察到“菌体红色、内部含绿色芽胞”的过渡状态。

四、关键注意事项

菌龄选择:芽胞的形成需要一定时间(如枯草芽孢杆菌需培养 48-72h,破伤风梭菌需厌氧培养 5-7 天),若菌龄过短(仅对数期营养体),则无芽胞形成,染色结果无效。

加热控制:初染时需用小火缓慢加热,避免染液沸腾(导致菌膜焦化)或干涸(染料结晶影响观察),若染液减少需及时补充。

脱色适度:脱色时用蒸馏水缓慢冲洗,不可用酒精(酒精会破坏芽胞结构),且冲洗时间不宜过长(防止芽胞内染料被过度洗脱)。

安全操作:加热时需在石棉网上进行,避免载玻片直接接触火焰导致破裂;使用油镜后需用擦镜纸蘸二甲苯清洁镜头。

五、应用场景

芽胞染色主要用于鉴别产芽胞细菌,尤其是在医学和食品微生物学中具有重要意义:

医学诊断:区分致病性产芽胞菌(如破伤风梭菌、炭疽芽孢杆菌)与非产芽胞菌,辅助判断感染类型;

食品卫生:检测食品中是否存在耐高温的芽胞菌(如蜡样芽孢杆菌,可引起食物中毒),评估食品加工的灭菌效果;

微生物分类:根据芽胞的形态、位置等特征,辅助细菌的属、种鉴定(如梭菌属芽胞多为末端或次末端,芽孢杆菌属芽胞多为中央)。

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