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大鼠骨髓间充干分化来源的内皮祖细胞的鉴定标准!

2026-01-21 15:19阅读:
大鼠骨髓间充干分化来源的内皮祖细胞的鉴定标准!



大鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs)分化来源的内皮祖细胞(EPCs)鉴定需遵循「表型特征 + 功能特性」双验证原则,二者缺一不可,以此确保细胞的内皮分化潜能和功能活性。具体鉴定标准如下:

一、细胞形态学鉴定(直观初筛)

诱导培养 7-14 天后,通过倒置显微镜观察细胞形态变化:

早期(1-5 天):细胞由 rBMSCs 的梭形逐渐转变为小圆形、鹅卵石样,出现细胞集落。

中期(5-10 天):集落扩大,细胞间连接紧密,部分细胞伸出细长伪足,形成线状排列。

成熟期(10-14 天):细胞呈典型的纺锤形或铺路石样,在 Matrigel 基质胶上可自发形成管腔样网状结构,这是内皮细胞的标志性形态。

二、表面标志物表型鉴定(流式细胞术/免疫荧光)

EPCs 兼具干细胞标志物和内皮细胞标志物的表达,需通过特异性抗体检测:

检测方法 核心标志物 结果判定标准

流式细胞术 干细胞标志物:CD133、CD34、VEGFR-2(FLK-1) 内皮细胞标志物:CD31、VE-cadherin、vWF 排除标志物:CD45(造血细胞)、CD11b(巨噬细胞) 诱导后 CD133阳性率约 40%-60%,CD34约 30%-40%,VEGFR-2约 35%-45%;内皮标志物阳性率需>50%,排除标志物阳性率<5%

免疫荧光染色 CD31、VE-cadherin、vWF 荧光信号定位于细胞膜或细胞质,阳性细胞占比>60%;vWF 表现为细胞质内点状荧光(特征性分布)

三、功能特性鉴定(金标准)

表型鉴定合格后,需进一步验证细胞的内皮功能,这是区分成熟内皮细胞与 EPCs 功能活性的关键:

双荧光吞噬结合实验

原理:EPCs 可特异性吞噬乙酰化低密度脂蛋白,并结合荆豆凝集素 1。

操作:将诱导后的细胞与 DiL-ac-LDL(37孵育 4h)和 FITC-UEA-1(室温孵育 1h)共孵育,荧光显微镜下观察。

判定:双阳性细胞(红色 + 绿色荧光)占比≥70% 为功能合格的 EPCs。

Matrigel 基质胶管腔形成实验

操作:将 Matrigel 胶铺于 24 孔板,待胶凝固后接种 1×10 个 EPCs,培养 6-12h 后镜检。

判定:细胞可形成连续、完整的管状网络结构,计数管腔分支点数≥20 个/视野(200×)为阳性。

体外血管生成相关功能(可选)

增殖迁移能力:通过 CCK-8、Transwell 实验检测,EPCs 在 VEGF 刺激下增殖率和迁移率显著升高。

分泌功能:可分泌 VEGF、bFGF 等促血管生成因子,通过 ELISA 检测验证。

四、电镜超微结构鉴定(进阶验证)

透射电镜下观察,EPCs 细胞质内可见小体,这是内皮细胞特有的细胞器,呈长杆状、有膜包被,内含因子,是鉴定内皮源性细胞的特异性超微结构标志。

关键质控要点

需设置未诱导 rBMSCs 对照组,对照组应不表达或低表达内皮标志物,且无管腔形成能力。

流式检测需设置同型对照,排除非特异性结合干扰。

功能实验中,Matrigel 胶需全程冰上操作,避免提前凝固影响实验结果。

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