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黑曲霉涂布操作前准备工作与核心步骤及注意事项有哪些？

2026-03-03 15:31阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/7058810482

黑曲霉涂布操作前准备工作与核心步骤及注意事项有哪些？





黑曲霉涂布操作的核心是无菌操作与均匀涂布，需通过制备菌悬液、倒平板、梯度稀释（可选）、涂布等步骤，最终获得单菌落或均匀的菌苔，具体步骤如下：

一、操作前准备（关键：无菌环境与物料）

1、环境与器具灭菌

超净工作台提前 30 分钟开启紫外灯灭菌，随后切换为送风模式。

涂布棒、EP 管、移液枪枪头、生理盐水（或无菌水）需经高压蒸汽灭菌（121，20 分钟）；培养皿需干热灭菌（160-180，2-3 小时）。

黑曲霉专用培养基（如 PDA 培养基，含马铃薯浸粉、葡萄糖、琼脂）灭菌后，置于 50-60水浴中保温（防止凝固）。

2、菌种与试剂准备

取活化好的黑曲霉菌种（斜面培养基培养 3-5 天，长满孢子），提前在超净台旁准备好。

若需梯度稀释，准备无菌生理盐水（0.85% NaCl），按 10¹、10²、10³ 等梯度分装 EP 管（每管 9mL）。

二、核心操作步骤（分“倒平板→制菌悬液→涂布”三步）

1、倒平板（奠定无菌培养基础）

戴无菌手套，在超净台内取出灭菌后的培养皿，打开皿盖（仅打开 1/3，避免污染）。

用无菌移液管吸取 15-20mL 保温的 PDA 培养基，倒入培养皿中，轻轻晃动使培养基均匀覆盖皿底。

盖上皿盖，置于水平桌面，待培养基自然凝固（约 20-30 分钟，避免移动），标记培养基名称与日期。

2、制备黑曲霉菌悬液（关键：分散孢子/菌丝）

用无菌移液管吸取 5-10mL 无菌生理盐水，注入黑曲霉斜面菌种管中。

用无菌接种环轻轻刮取斜面表面的黑曲霉孢子（避免刮伤培养基），反复吹吸生理盐水，使孢子充分分散到液体中，制成初始菌悬液。

若菌悬液有菌丝团，可用无菌纱布过滤（或用移液枪反复吹吸），确保孢子单一分散。

3、梯度稀释（可选：需单菌落时操作）

用无菌移液枪吸取 1mL 初始菌悬液，注入装有 9mL 无菌生理盐水的 EP 管中（10¹ 稀释度），盖紧盖子后反复颠倒混匀（至少 10 次）。

按上述方法，从 10¹ 稀释管中吸取 1mL 菌悬液，注入新的 9mL 无菌生理盐水管中（10² 稀释度），依次制备所需稀释度（黑曲霉常用 10³-10稀释度）。

4、涂布操作（核心：均匀分布）

用无菌移液枪吸取 0.1-0.2mL 目标稀释度的菌悬液，滴加在已凝固的 PDA 平板中央（每平板 1 份菌悬液）。

取灭菌后的涂布棒（可在酒精灯外焰快速过一下，冷却 10 秒后使用，避免烫伤菌种），将菌悬液从平板中央向四周轻轻推动，确保菌液均匀覆盖整个培养基表面（同一方向推 2-3 次，再旋转平板推 2-3 次）。

涂布完成后，打开皿盖，在超净台内静置 5-10 分钟，让菌悬液中的水分充分吸收（避免培养时菌液流动）。

5、培养与观察

将平板倒置（皿盖在下，皿底在上，防止冷凝水滴落污染菌落），放入 28-30恒温培养箱中，培养 3-5 天。

培养期间定期观察，待平板上出现黑曲霉的典型菌落（黑色孢子层，周围有白色菌丝），即可停止培养，进行后续计数或纯化。

三、关键注意事项（避免操作失败）

严格无菌：所有操作需在超净台内进行，手部、器具避免接触非无菌区域；涂布棒冷却不彻底会杀死菌种，冷却过度可能导致污染，可通过触碰培养基边缘测试温度（无烫痕即可）。

菌悬液分散：黑曲霉易形成菌丝团，制备菌悬液时需充分吹吸或过滤，否则涂布后菌落聚集，无法获得单菌落。

涂布力度：推动涂布棒时力度要轻，避免划破培养基表面，导致菌液残留，影响菌落形态。

稀释度选择：若目标是单菌落，需通过预实验确定合适稀释度，确保每平板菌落数在 30-300 之间（便于计数）；若仅需菌苔，可直接用未稀释的菌悬液涂布。

四、总结

黑曲霉涂布的核心是“无菌 + 均匀”：前期做好灭菌与物料准备，中期通过轻柔操作实现菌悬液均匀分布，后期控制培养条件，即可高效获得目标菌落。操作时需重点关注菌悬液分散度与涂布棒温度，避免因污染或操作不当导致实验失败。

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