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大鼠垂体瘤细胞的消化传代与复苏冻存及培养注意事项!

2026-04-14 14:57阅读:
大鼠垂体瘤细胞的消化传代与复苏冻存及培养注意事项!





大鼠垂体瘤细胞是由Tashjian等在1965年7月从一只7月龄的雌性大鼠的垂体肿瘤中分离建立的。GH3细胞系不是直接来源于GH1细胞系的克隆,而是从原代培养的GH1细胞在大鼠身上传代两次形成的肿瘤中建立的。上皮样的GH3细胞比GH1分泌更高水平的生长激素,也可产生催乳素。对调控GH3细胞分泌蛋白类激素的研究表明,氢化可的松可以刺激生长激素的分泌、抑制催乳素的产生。

一、培养基与血清(最容易踩坑)

GH3 必须使用 Ham’s F-12K 培养基,不可随意替换为 DMEM、1640 等。

血清配比严格:

15% 马血清(HS)+ 2.5% 胎牛血清(FBS)

不可只用 FBS 替代 HS,否则激素分泌、贴壁性会显著下降。

血清批次差异大,必须做批次验证,同一批血清尽量大批量采购。

培养基 pH 严格控制在 7.2–7.4,CO 浓度保持 5%。

二、细胞形态特殊:半贴壁/悬浮特性

GH3 是半贴壁 + 半悬浮,传代时必须同时收集上清和贴壁细胞,否则细胞大量丢失。

MMQ 为纯悬浮,需维持合适密度,过低易死亡。

培养过程中不要频繁晃动培养瓶,否则贴壁细胞易脱落。

三、消化与传代

使用 0.25% 胰酶 - EDTA,消化时间1–2 min即可,严禁过度消化。

看到细胞间隙变大、开始收缩就立即终止消化。

传代比例通常 1:2~1:4,不要过度稀释。

吹打轻柔,避免产生气泡,防止细胞机械损伤。

四、复苏与冻存

复苏要快融(37水浴 1 min 内完成),减少 DMSO 毒性。

冻存液推荐:

55% F-12K + 40% FBS + 5% DMSO

必须程序降温,不可直接放入 - 80。

早期代数(P10 以内)多冻存储备,垂体瘤细胞高代后激素分泌会下降。

五、激素分泌稳定性(科研关键)

传代次数越高,GH、PRL 分泌越不稳定,尽量使用低代细胞。

药物处理、换液、换血清批次都会影响分泌水平,实验前需稳定培养 1–2 代。

氢化可的松可上调 GH、下调 PRL,实验设计要统一条件。

六、污染防控

垂体瘤细胞生长较慢,更容易被支原体、真菌污染。

每次复苏、传代都应做支原体检测。

一旦出现细菌/真菌污染,直接丢弃,不建议挽救。

七、其他实验细节

细胞瓶/板无需包被(多聚赖氨酸等),常规培养即可。

换液时动作轻柔,避免冲起细胞。

悬浮细胞需定期混匀,防止沉降聚集。

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