一、材料准备
新生 SD 大鼠 1～3 天龄
解剖器械、培养皿、离心管、细胞筛（70 μm）
消化液：
0.25% 胰蛋白酶 + 0.1% 胶原酶 IV 1:1 混合
完全培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗
纯化用：
Forskolin（终浓度 2 μM）
Heregulin/HRG（终浓度 10 ng/mL）
多聚赖氨酸（PLL）包被培养瓶
二、原代分离步骤（全程无菌）
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新浪博客
一、材料准备
新生 SD 大鼠 1～3 天龄
解剖器械、培养皿、离心管、细胞筛（70 μm）
消化液：
0.25% 胰蛋白酶 + 0.1% 胶原酶 IV 1:1 混合
完全培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗
纯化用：
Forskolin（终浓度 2 μM）
Heregulin/HRG（终浓度 10 ng/mL）
多聚赖氨酸（PLL）包被培养瓶
二、原代分离步骤（全程无菌）
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、取材
75% 酒精消毒大鼠，取双侧坐骨神经。
剔除筋膜、血管，尽量剥去神经外膜。
2、剪碎
将神经移入少量培养基中，剪至 1 mm³ 以下。
3、消化
加入混合消化液，37 消化 45～60 min，每 10 min 轻弹一次。
加完全培养基终止消化。
4、吹打、过滤
反复吹打至无肉眼可见组织块。
70 μm 滤网过滤，去除残渣。
5、离心
1000 r/min，5 min，弃上清。
重悬细胞，接种到 PLL 包被的培养瓶。
三、纯化（关键：差速贴壁 + 选择性培养基）
1）第一次差速贴壁（去除成纤维细胞）
接种后 30～60 min，轻轻晃动，吸出未贴壁的上清，转入新的 PLL 瓶。
成纤维细胞贴壁快，已贴在第一个瓶里。
2）第二次差速贴壁
再孵育 30 min，再次收集未贴壁细胞，接种到新瓶。
此时大部分成纤维已被去除。
3）选择性培养基扩增
加入含：
Forskolin 2 μM
HRG 10 ng/mL
的完全培养基。
37、5% CO 培养，每 2～3 天换液。
4）传代时再次纯化
传代时重复 差速贴壁 1～2 次。
一般 P2～P3 即可获得 纯度 >90% 的施旺细胞。
四、鉴定（简单快速）
免疫荧光：S-100β 或 p75NTR 阳性。
形态：长梭形、双极、排列成漩涡状。
五、关键注意点
一定要 新生 1～3 天大鼠，成年鼠很难养。
神经外膜尽量剥干净，否则成纤维极多。
差速贴壁时间不能太长，否则施旺也贴住了。
纯化必须靠 差速贴壁 + 选择性培养基 一起用。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
75% 酒精消毒大鼠，取双侧坐骨神经。
剔除筋膜、血管，尽量剥去神经外膜。
2、剪碎
将神经移入少量培养基中，剪至 1 mm³ 以下。
3、消化
加入混合消化液，37 消化 45～60 min，每 10 min 轻弹一次。
加完全培养基终止消化。
4、吹打、过滤
反复吹打至无肉眼可见组织块。
70 μm 滤网过滤，去除残渣。
5、离心
1000 r/min，5 min，弃上清。
重悬细胞，接种到 PLL 包被的培养瓶。
三、纯化（关键：差速贴壁 + 选择性培养基）
1）第一次差速贴壁（去除成纤维细胞）
接种后 30～60 min，轻轻晃动，吸出未贴壁的上清，转入新的 PLL 瓶。
成纤维细胞贴壁快，已贴在第一个瓶里。
2）第二次差速贴壁
再孵育 30 min，再次收集未贴壁细胞，接种到新瓶。
此时大部分成纤维已被去除。
3）选择性培养基扩增
加入含：
Forskolin 2 μM
HRG 10 ng/mL
的完全培养基。
37、5% CO 培养，每 2～3 天换液。
4）传代时再次纯化
传代时重复 差速贴壁 1～2 次。
一般 P2～P3 即可获得 纯度 >90% 的施旺细胞。
四、鉴定（简单快速）
免疫荧光：S-100β 或 p75NTR 阳性。
形态：长梭形、双极、排列成漩涡状。
五、关键注意点
一定要 新生 1～3 天大鼠，成年鼠很难养。
神经外膜尽量剥干净，否则成纤维极多。
差速贴壁时间不能太长，否则施旺也贴住了。
纯化必须靠 差速贴壁 + 选择性培养基 一起用。
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