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小鼠乳腺上皮细胞的原代分离与培养操作流程及科研应用！

2026-06-09 15:28阅读：

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小鼠乳腺上皮细胞的原代分离与培养操作流程及科研应用！





小鼠乳腺上皮细胞（Mouse Mammary Epithelial Cells, MMECs）是构成小鼠乳腺组织的主要功能细胞，是研究乳腺发育、泌乳生物学及乳腺癌机制的核心体外模型。

一、基本特性

组织来源：通常分离自分娩后 3-5 天的哺乳期小鼠乳腺，此时期细胞活性与增殖能力最强。

形态特征：贴壁生长，呈多角形、短梭形，细胞边界清晰，紧密排列呈铺路石样单层。

分子标记：

腔上皮细胞 (Luminal)：表达 CK8/18

肌上皮/基底细胞 (Basal/Myoepithelial)：表达 CK14、α-SMA

生理功能：主要负责乳腺发育、泌乳（合成乳蛋白）、乳腺组织再生与重塑。

二、原代分离与培养（标准流程）

1、材料准备

实验动物：泌乳期（产后 3-5 天）小鼠

消化液：胶原酶 、胰蛋白酶 - EDTA

培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 胰岛素 (5μg/ml) + EGF (10ng/ml) + 双抗

包被：培养瓶/板需用鼠尾胶原 I预处理，促进贴壁

2、分离步骤

取材：无菌摘取乳腺，去除脂肪与结缔组织，PBS 冲洗。

剪碎：将组织剪成 < 1mm³ 的碎块。

消化：加入胶原酶 ，37摇床消化 1-2 小时。

过滤：用 40-70μm 细胞筛过滤，去除未消化组织块。

离心：300×g 离心 5 分钟，弃上清。

红细胞裂解：加入红细胞裂解液处理 3-5 分钟。

洗涤：用基础培养基重悬，离心洗涤 2-3 次。

接种：细胞计数，按 1×10 cells/cm² 密度接种于包被好的培养瓶中。

3、培养维护

培养条件：37，5% CO 饱和湿度培养箱。

换液：24 小时首次换液（去除未贴壁细胞），之后每 2-3 天换液一次。

传代：细胞汇合度达 80%-90% 时传代。原代细胞通常可传 1-3 代，代数过高易分化或成纤维细胞污染。

三、常用细胞系

原代细胞寿命有限，科研中常用永生化细胞系：

HC11：最常用，来自怀孕小鼠，可在激素诱导下分化并表达乳蛋白。

C57MG：来自 C57BL/6 小鼠，常用于 Wnt 信号通路及乳腺肿瘤转化研究。

EpH4：具有正常乳腺上皮极性，可形成三维腺泡结构，用于发育与形态发生研究。

四、主要科研应用

1、乳腺发育生物学

研究青春期、妊娠期、泌乳期及退化期的细胞增殖、分化与凋亡机制。

探索激素（雌激素、孕激素、催乳素）与生长因子的调控网络。

2、泌乳机制与乳品科学

研究乳蛋白（酪蛋白、乳清蛋白）的合成调控与分泌过程。

评估营养因子、环境毒素对泌乳功能的影响。

3、干细胞与组织工程

分离与鉴定乳腺干细胞（MaSC），研究其自我更新与分化潜能。

构建乳腺类器官（Organoid），实现体外长期三维培养，高度模拟体内生理结构。

五、常见问题与注意事项

成纤维细胞污染：乳腺组织富含纤维间质，分离时易混杂。可通过差速贴壁法（成纤维细胞贴壁更快）或免疫磁珠分选纯化上皮细胞。

难以贴壁：必须使用胶原包被的培养器皿，并在培养基中添加胰岛素、EGF 等促生长因子。

分化与衰老：原代细胞传代次数有限，连续培养会逐渐丧失泌乳功能。建议使用低代次（P0-P2）细胞进行关键实验。

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