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总大肠菌群酶底物法的核心原理与操作流程及质控要点!

2026-08-04 14:50阅读:
总大肠菌群酶底物法的核心原理与操作流程及质控要点!





百欧博伟生物:总大肠菌群酶底物法是基于总大肠菌群产生的 β- 半乳糖苷酶水解色原底物产生颜色变化,通过多管法或定量盘法计数阳性反应并查 MPN 表定量的快速检测技术,核心标准为 HJ 1001-2018 与 GB/T 5750.12-2023,适用于地表水、地下水、生活饮用水、污水等,24h 可出结果,结果以 MPN/100mL 表示。以下从原理、流程、质控等方面详细说明:

一、核心原理

总大肠菌群 36.5±0.5培养 24h±2h 条件下可产生 β-D - 半乳糖苷酶,该酶能水解培养基中无色的邻硝基苯 -β-D - 吡喃半乳糖苷(ONPG),生成黄色的邻硝基苯酚,以此判定阳性反应;若同时检测大肠埃希氏菌
可通过其产生的 β- 葡萄糖醛酸酶水解荧光底物 MUG 产生荧光辅助判断。

二、关键试剂与仪器

试剂:酶底物试剂(含 ONPG、选择性抑菌剂等)、无菌水、硫代硫酸钠(除氯)、EDTA 二钠(除重金属)、阳性对照菌(如大肠埃希氏菌)、阴性对照菌(如假单胞菌)。

仪器:无菌采样容器、定量盘(51 孔/97 孔)或试管、封口器、恒温培养箱(36.5±0.5)、紫外灯(可选,用于大肠埃希氏菌荧光检测)。

标准操作流程(以 HJ 1001-2018 为例)

样品采集与保存:用无菌容器采集 100mL 水样,含氯样品加硫代硫酸钠,含重金属样品加 EDTA 二钠,0-4冷藏,6h 内分析,最长不超过 24h。

样品制备:水样摇匀,无需稀释或按污染程度梯度稀释,确保阳性孔数在有效计数范围。

三、接种与培养

多管法:取不同稀释度水样加入无菌试管,每管加酶底物试剂,封口后 36.5±0.5培养 24h±2h。

定量盘法:将 100mL 水样与酶底物试剂混匀,倒入 51 孔/97 孔定量盘,封口后同温同时间培养。

结果观察与计数:培养后,试管/定量盘孔内呈黄色为总大肠菌群阳性,统计阳性数,查对应 MPN 表得 MPN/100mL,全阴性则报告未检出。

结果报告:按标准保留有效数字,≥100MPN/100mL 用科学计数法,注明方法与检出限。

四、质量控制要点

质控环节 具体措施

空白对照 每批实验设无菌水空白,确保无阳性,排除污染

阳性对照 用大肠埃希氏菌标准株做阳性对照,保证试剂与培养有效

阴性对照 用假单胞菌等非目标菌做阴性对照,验证抑菌特异性

平行样 每批样品做 10% 平行样,相对偏差需符合标准要求

计数质控 严格按定量盘/多管对应的 MPN 表查值,避免误判颜色

五、干扰与消除

余氯:采样时加硫代硫酸钠还原,消除酶抑制。

重金属:加 EDTA 二钠络合,降低细胞毒性。

高浊度/有色水样:适当稀释后检测,避免影响颜色判读。

杂菌干扰:酶底物试剂含抑菌剂,可抑制多数异养菌,减少假阳性。

六、方法优势与局限

优势:无需配制培养基,操作快,24h 出结果,特异性强,适配多场景检测。

局限:高色度/高浊度水样需稀释,依赖颜色判读,需严格质控避免污染与误判。

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