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重组细胞构建方法——重组蛋白药物制药技术之五

2018-12-20 11:35阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1017048994

第二节 重组蛋白药物的制备
一、表达工程细胞的构建
（二）表达宿主细胞构建的技术方法
2．DNA重组与克隆
分子克隆技术是一组复制DNA分子并构建具有相同DNA分子的细胞群的分子生物学实验方法。包括在体外将目的基因DNA分子片段插入到克隆载体上，形成重组克隆载体，将其转化或转染到宿主细胞中，通过细胞的增殖培养，可从细胞中分离获得大量重组克隆载体，实现目的基因DNA分子片段的扩增。是现代生物学和医学领域的核心技术。
（1）重组表达载体构建
必要时，选择重组克隆载体上合适的两个酶切位点，与表达载体上的酶切位点相同，且表达方向一致。在内切酶作用下，目的基因DNA与表达载体分别被切成双链线性
DNA。然后在DNA连接酶作用下连接成一个闭环双链DNA，称之为重组表达载体。
重组细胞构建方法——重组蛋白药物制药技术之五 图2-5 重组载体构建示意图
有的限制性内切酶将DNA双链末端切为粘端，即一条链比其互补链长几个核苷酸，目的基因DNA易与载体DNA互补连接；部分酶切末端为平端，即双链一样长，这样不易连接或连接效率略差；尽量选择两端皆为粘端的内切酶，或至少一端为粘端。酶切位点的选择在重组克隆载体时也需要注意，合成的基因片段两端需要留足够让限制性内切酶结合的长度。
（2）基因转染技术
重组载体转入宿主细胞的过程称为转染（transfection）。也有人将重组载体进入宿主细胞的过程根据载体、宿主细胞的不同分别给定义成转化（transformation，重组质粒进入原核细胞）、转染（重组质粒进入真核细胞）、转导（transduction，重组病毒载体进入宿主细胞），以及感染（infection，重组病毒载体进入宿主细胞的过程）等各种名词，在生物技术制药语境下，这些名词没有本质上的区别。
通常转染包括非病毒载体转染技术（电穿孔、基因枪、磷酸钙共沉淀、感受态细胞、脂质体复合物等）和病毒载体转染技术。
电穿孔（electroporation）是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而使DNA透入细胞内，也叫电转染。基因枪（Gene gun或Biolistic）技术一般指采用高压气体将包裹着DNA的球状金粉或钨粉颗粒直接送入细胞或组织，也被称为微粒轰击（particle bombardment）技术。磷酸钙DNA共沉淀（calcium phosphate-DNA coprecipitation）法是将DNA与CaCl2混合，然后加入到磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，再将含有沉淀的混悬液加到细胞上，通过细胞膜内吞作用摄入DNA。另一种变通方法是将原核细胞（如大肠杆菌）置于0℃低渗CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导细胞成为感受态细胞；细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物；将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收，这个方法也称为感受态细胞（competent cell）法。脂质体复合物（liposome complex）法也称为脂质体介导（liposome mediated）法，即表面带正电荷的阳离子脂质体可以与带负电荷的DNA通过静电作用形成复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用，偶尔也可通过渗透作用，复合物被传递进入细胞形成包涵体或进入溶酶体，脂质体被溶解，DNA被释放到细胞浆，或者进入细胞核。
病毒载体通常由表达质粒和包装质粒组成，表达质粒包含包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，包装质粒提供从转录、包装到重组成假病毒载体所需的所有辅助蛋白。将表达质粒与包装质粒共同转染包装细胞，在细胞中完成病毒的包装，包装好的假病毒分泌到细胞外上清中，经离心收集病毒颗粒，即可用于对宿主细胞的转染。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒载体等。其中部分载体包装后会裂解包装细胞从而被释放。
重组载体转染宿主细胞成功后，称之为重组工程细胞。
（3）基因表达技术
重组工程细胞中的重组载体以两种形式存在，一种是以独立的重组载体存在于细胞质中，在细胞分裂增殖中，载体被均匀分配到分裂后两个细胞，在传代过程中，有一定几率才出现逐步减少，乃至最后重组载体拷贝数降低，甚至丧失重组载体的情况；另一种是重组载体（至少包括目的基因和标记基因等）整合到宿主细胞的染色体上，在细胞增殖分裂时，目的基因和标记基因随染色体复制而存在于两个子代细胞的染色体上。
重组工程细胞可通过重组载体或细胞自身的蛋白表达系统，实现目的基因转录和翻译（translation）过程，表达目的蛋白。
作为原核细胞表达载体的重组大肠杆菌，主要通过培养条件改变诱导蛋白表达，主要有胞内包涵体（inclusion bodies）表达、胞内可溶性（soluble）表达和胞外分泌（secretion）表达等三种形式。酵母细胞主要是诱导分泌表达目的蛋白的方式。哺乳动物细胞一般有诱导表达、瞬时表达和稳定表达等方式，通过重组载体或者细胞染色体中目的基因前端的启动子、增强子、信号肽、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子、翻译终止密码子、拼接信号、多聚腺苷酸信号等各类调节基因，以及各类酶基因的共同作用下，实现目的基因的转录、翻译以及修饰等过程，最后在胞内表达并分泌到胞外。为了目的蛋白的稳定或易于后续分离筛选，常常构建融合蛋白基因来表达融合蛋白。作为重组蛋白药物，原则上要求最后将融合蛋白中的目的蛋白分离出来。
重组细胞构建方法——重组蛋白药物制药技术之五
重组细胞构建方法——重组蛋白药物制药技术之五
图2-6 重组DNA载体转染宿主细胞后的存在方式
（4）遗传稳定性与表达稳定性
遗传稳定性与表达稳定性常常采用质粒丢失率检测方法来确定。对于重组表达载体独立存在于宿主细胞的情况，通常采用加压方式以保障重组工程细胞中的重组载体稳定存在，即在抗生素等存在条件下，只有保证一定数量重组质粒的工程细胞才能正常生长繁殖，而丢失重组质粒的工程细胞被破坏。但在生产过程中，培养基中一般不能含有抗生素，因此必须选择那些可以在无抗性加压方式下传代足够代次而不丢失重组质粒的工程细胞作为生产的种子批保存。举例来说，譬如一种工程菌在生产过程中需要传代60代，我们将其在无抗生素条件下培养20~30代，然后将培养液点样到无抗生素固体培养基平板上培养，共100个点；待其长成合适菌落后，分别接种到含抗生素固体培养基平板上培养，如果有100个菌落长成，称为质粒稳定率为100%；重复4~6次，即工程菌在无抗性培养基中传代90~120代，如果质粒稳定率不低于95%，该菌种可以作为生产用种子。否则，必须重新筛选，甚至重新克隆、转染构建工程细胞。
重组细胞构建方法——重组蛋白药物制药技术之五 LB琼脂平板(Amp-) LB琼脂平板(Amp+)
图2-7 稳定性结果图（50个总菌落，实测应各有2块LB琼脂平板）
质粒稳定率 = LB琼脂平板(Amp+)菌落数／LB琼脂平板(Amp-)菌落数

对于重组载体整合到宿主细胞染色体的情况，需要不断提高加压水平，以筛选出整合目的基因最高的工程细胞。举例来说，譬如某重组表达载体上的遗传标记基因DHFR（二氢叶酸还原酶）具有抵抗MTX（甲氨蝶呤）的作用，当DHFR与目的基因一道被整合到宿主细胞染色体后，该工程细胞具有在含MTX的培养基中生长繁殖的能力；将培养基中MTX浓度从0.0

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