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蛋白分离纯化的基本流程和基本要求——重组蛋白药物制药技术之十五

2019-02-27 23:05阅读:
第二节 重组蛋白药物的制备
三、表达产物的分离纯化
(二)蛋白分离纯化的基本流程和基本要求
在上述列举的各类蛋白分离纯化技术中,离心、过滤、盐析、沉淀、透析等大都是物理学技术,相对比较温和而简便,一般来说耗时较短,对蛋白结构和性状影响较小,甚至没有影响,因此可以根据需要多次应用,作为主要分离技术中间的过度。
层析、变性复性、电泳、吸附等大部分是生化技术、有机化学技术或生物学技术,分离效率高,但是操作相对复杂,一般分离时间较长,对蛋白质的结构或性状相对影响较大因此,这类技术方法在整个蛋白质分离过程中往往作为分离纯化的主要技术,尽量只使用一次。不同原理的层析技术可以先后使用,同一分离原理的层析技术不要重复使用。
一般情况下,重组蛋白不能靠单一的分离纯化技术方法达到最终要求,通常需要多种技术组合使用。具体针对哪种目的蛋白采取何种技术组合方式,需要对目的蛋白的性质,表达方
式,在原料中的状态,以及原料中其他杂质的性质综合判断。一般原则是:首先采取成本最低,可以将大部分杂质分离,对目的蛋白影响最小,最大程度缩小原料体积的技术方法;然后在主要分离纯化步骤中尽量采用过滤与层析等效率高的分离技术;特殊情况下采用成本最高的限速技术如凝胶过滤、亲和层析等作为精细纯化最后步骤,达到蛋白原液的纯度要求。
根据国家药监局新药审评中心出台的有关指导原则,当临床单剂量蛋白用量为μgng级别,或者采用原核细胞表达的目的蛋白时,一般蛋白纯度不得低于95.0%;当临床单剂量蛋白用量为mg级别,或者采用真核细胞表达时,重组蛋白纯度不得低于98.0%;对于一些临床剂量特别大的产品,如重组人血清白蛋白,临床剂量可达10g水平,可能其纯度要求不得低于99.9999%;对于一些临床剂量或表达方法不能按照上述原则确定的蛋白品种,需要与新药审评中心进行沟通,确定具体纯度标准。目前,对于重组蛋白纯度的检测方法要求至少两种以上,一般采用还原型十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresisSDS-PAGE和高效液相色谱(High-performance liquid chromatographyHPLC其中,HPLC技术要求以对目的蛋白纯度变化最敏感的色谱柱来检测。另外,考虑蛋白药物有一定的效期,而蛋白在存放效期内,会出现一些纯度下降的情况。因此,需要考虑分离纯化获得的蛋白纯度必须高于指导原则中的纯度要求,这样,才能保证效期内的蛋白纯度不低于指导原则中的要求。

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