应用illumina SNP基因芯片进行SNP检测实验流程
2013-08-16 13:35阅读：
摘要: 应用illumina SNP基因芯片进行SNP检测实验流程 一、
样本信息及处理方法人血液DNA样本，共60个。样本用DNA Clean ConcentratorTM-5 (ZYMO
RESEARCH, Catalog No. D4013) 试剂盒进行纯化， U.V.测量和电泳检测
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应用illumina SNP基因芯片进行SNP检测实验流程
一、
样本信息及处理方法
人血液DNA样本，共60个。样本用DNA Clean & ConcentratorTM-5 (ZYMO RESEARCH,
Catalog No. D4013) 试剂盒进行纯化， U.V.测量和电泳检测合格的样本，进行Illumina Infinium
610-Quad 芯片分析。
二、
DNA的定量信息
用 NanoDrop紫外分光光度计进行进行U.V.测量， A260/A280应接近2.0为较纯的样本(A260/A280
在1.8-2.1)。用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，筛选合格的样本。部分样本信息如下:
|
ng/ul
|
260/280
|
260/230
|
Call rate
|
D76
|
168.21
|
1.89
|
2.03
|
0.9907
|
D71
|
167.78
|
1.88
|
2.02
|
0.9847
|
D11
|
59.5
|
1.9
|
2.36
|
0.9902
|
D42
|
57.66
|
2
|
2.21
|
0.9988
|
D8
|
56.66
|
1.94
|
2.26
|
0.9990
|
D90
|
70.13
|
1.94
|
2.35
|
0.9952
|
D56
|
79.27
|
1.93
|
2.31
|
0.9989
|
D47
|
184.21
|
1.91
|
2.11
|
0.9988
|
D16
|
54.34
|
1.96
|
2.23
|
0.9986
|
D13
|
58.93
|
1.93
|
2.25
|
0.9935
|
D39
|
78.96
|
1.93
|
2.3
|
0.9916
|
D10
|
98.95
|
1.95
|
2.3
|
0.9983
|
三、
实验基本流程
1.
DNA定量
测定DNA浓度，并统一标化成50ng/μL。进行Infinium HD® 610-Quad
Assay分析需要的DNA样本量为200ng。
2.
DNA扩增
在样本中加入0.1N
NaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂，在37℃恒温条件下过夜孵育，扩增后的DNA总量可达初始上样量的2000-3000倍。
3.
DNA片段化
扩增后的产物，经过可控的且不需要凝胶电泳的酶解处理，成为片段化的DNA。该过程利用终点式（end-point）片段化方法，以防止样本的过度片段化。
4.
DNA沉淀
通过加入异丙醇沉淀DNA片段，片段化的DNA在4℃下离心富集，从而得以纯化。
5.
DNA重悬
沉淀后的DNA在空气中干燥后，加入杂交缓冲试剂使DNA沉淀重新溶解。
6.
DNA与芯片的杂交
将重悬后的DNA样本与准备好的芯片杂交，置于杂交炉内反应过夜。在杂交过程中，片段化后的DNA经过变性，与位点特异的50个碱基退火，而这50个特异碱基连接在芯片的610，000种微珠（bead）中的一个上，一个微珠类型对应检测一个SNP或CNV位点。
7.
芯片的延伸、染色
洗去未杂交的和非特异杂交的DNA，以便后续的染色和延伸。以捕获到的DNA为模板，在芯片上进行单碱基的延伸反应，在芯片上加上可检测的标签基团，从而区分样本的SNP类型。
包被芯片：将反应完成的芯片放入XC4试剂中，使其表面包裹上一层粘性透明液体，再将其放入真空环境下干燥1小时，从而将芯片包被，保护其信号稳定较长的时间。
8.
芯片的扫描
将处理好的芯片放入扫描仪中，利用激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光，并生成高分辨率的图片。由此所得的数据直接导入BeadStudio软件进行分析，从而就得到每个样本的SNP分型数据。
具体流程图见附录。
四、
实验质控
Illumina Infinium II
芯片分型中，引入了一系列控制探针监测整个杂交实验过程。分为非样本依赖型Control和样本依赖型Control。非样本依赖型Control包括染色控制探针（Staining
controls）、延伸控制探针（Extension controls）、目标移除控制探针（Target removal
controls）和杂交控制探针（Hybridization
controls）。样本依赖型Control包括严谨性控制探针(Stringency
controls)、非特异性结合控制探针（Non-specific binding controls）和非多态性控制探针（Non-
polymorphic (NP) conrols）。
本实验的质控探针信号值见《ControlDashboard.csv》，质控探针信号图像见Control
Summary文件夹。该实验的Control 显示，所有样本的实验过程都是可信的。
五、
数据分析说明
所有分型的60个样本与国际HapMap Project
的206个对照样本一起进行聚类分析。这206个对照样本包括：57个非洲人（YRI）、44个日本人（JPT）、45个中国汉族人（CHB）和60个CEPH（Utah
residents with ancestry from northen and western Europe,
CEU）。聚类后，利用BeadStudio软件中Calculate工具，计算p10 GC，p50 GC和Call
Rate值，最后生成Final Report、Loci Summary 和DNA Report。60个样本的平均call
rate为0.9958。
Final Report 中有以下五列：SNP Name、Sample Name、Allele1、Allele2和GC
Score。
Loci Summary
中有以下十列：Locus_Name、No_Calls、Calls、all_Freq、A/A_Freq、A/B_Freq、B/B_Freq、Minor_Freq、50%_GC_Score、10%_GC_Score。
DNA
Summary中主要有以下几列：DNA_Name、#No_Calls、#Calls、Call_Freq、50%_GC_Score、10%_GC_Score。
