溶酶体的发现者－德迪夫（ChristiandeDuve）

2018-11-08 22:40阅读：

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溶酶体的发现者－德迪夫（ChristiandeDuve）

1974年，克洛德、帕拉德和德迪夫“由于细胞结构和功能组织的发现”而分享诺贝尔生理学或医学奖。诺贝尔奖委员会的评价是“三人的研究成就为现代细胞生物学诞生发挥了重要作用”。
克洛德发明现代细胞生物学两项基本技术，帕拉德进一步完善电子显微镜在细胞结构研究中的应用，而德迪夫则改进细胞组分分级分离技术，为细胞生物学研究提供了全新手段。另一方面，三位科学家还各自发现了新细胞器：克洛德发现内质网以及线粒体精细结构，帕拉德发现核糖体，德迪夫先后鉴定出溶酶体和过氧化物酶体奠定了现代细胞生物学基础，对推动细胞生物学乃至生命科学发展具有重要意义。
下面着重介绍德迪夫（Christian de Duve，1917－2013年）在生物科学研究中的成果。
一、生平简介

1917年10月2日，德迪夫出生于英国伦敦郊外泰晤士迪顿，德迪夫在安特卫普的圣母学院完成初等教育，1934年秋进入天主教勒芬大学学习，专业是古代人文。大学期间，德迪夫学习了拉丁文、哲学和数学等课程，但对医学和科学更感兴趣，树立终身从事科研的理想。1938年，德迪夫毕业后一方面就读医学院并最终获得医学学位（1941年），另一方面开始胰岛素研究。
二、主要贡献
1．生物化学研究－胰岛素和胰高血糖素
1935年，德迪夫进入生理学家鲍卡尔特（J. Bouckaert）实验室工作。鲍卡尔特重点研究胰岛素作用机制。当时有两种观点,多数推测胰岛素作用于外周肌肉发挥效应，而少数认为胰岛素影响肝脏葡萄糖代谢，鲍卡尔特认为后者更接近真实。德迪夫通过实验支持了鲍卡尔特的观点。
第二次世界大战的爆发严重影响了德迪夫的实验进程。战争期间，德迪夫加入比利时军队，作为军医为士兵服务。但一次在法国南部执行任务的过程中不幸被德军俘获，在随后押往战俘营时凭借自身语言天赋（熟练的德语能力）而成功逃脱。回到比利时后,德迪夫将前期结果归纳总结后发表在比利时生理学家海曼斯（C. Heymans，1938年诺贝尔生理学或医学奖获得者）主办的杂志上。1945年德迪夫撰写了专著《葡萄糖、胰岛素和糖尿病》，同年分别在布魯塞尔和巴黎出版。德迪夫还综述了胰岛素进展并推测胰岛索的作用机制。论文的发表使德迪夫逐渐在胰岛素研究领域崭露头角，为进一步工作奠定了基础。
1944年5月，德迪夫认为胰岛素注射升血糖效应是由于混有胰高血糖素的缘故，胰高血糖素也由胰腺产生，因此在胰腺提取物分离胰岛素的过程中容易混有胰高血糖素，通过结晶才可分离。德迪夫怀疑美国礼米公司的胰岛素存在胰高血糖素污染，用礼来公司胰岛素注射兔子可引起高血糖，而自己制备的胰岛素则不存在这种效应。礼来公司进一步的研究证实了德迪夫的结果，所以不仅没有为难德迪夫，反而在财政上支持他的科学研究，为德迪夫独立开展实验提供了资金保证。
1946年，德迪夫由于青霉素纯化的工作获得化学硕士学位。德迪夫为更深人理解胰岛素作用的生物化学机制，申请到瑞典生物化学家特奥雷尔（H.Theorell， 1955年诺贝尔生理学或医学奖获得者）实验室工作。在18个月时间里，德迪夫系统掌握了生物化学的基本操作，并参与了人血红蛋白纯化，逐渐成长为一名优秀的生物化学家。由于特奥雷尔并不从事胰岛素研究，因此德迪夫决定寻找新的工作单位。
1947年秋，德迪夫回到比利时，获得勒芬大学生理化学讲师职位，但根据合同需要到1948年1月底才能开始工作，他决定充分利用短短几个月的时间来开展胰岛素工作。德迪夫获得进入美国华盛顿大学糖代谢研究大师科里夫妇实验室的机会，在特奧雷尔帮助下申请到洛克菲勒基金会奖学金以完成旅程。德迪夫到达美国圣路易斯后，科里夫妇去瑞典参加1947年诺贝尔生理学或医学奖的颁奖仪式了，因此他与实验室博士后萨瑟兰（E.Sutherland，1971年诺贝尔生理学或医学奖获得者）进行合作。
德迪夫和萨瑟兰的合作富有成效短短4个月，他们初步确定胰高血糖素由胰腺α细胞生成。回到比利时，德迪夫继续深入研究胰高血糖素，以证实α细胞的来源。他用金属钴处理豚鼠以选择性地破坏胰腺α细胞，结果胰高血糖素含量急剧降低但胰岛素无变化；对富含胰腺α细胞的鸟类检测，发现含有更高浓度胰高血糖素，这些证据确定胰高血糖素由α细胞生成。这项工作有效地揭示出，同一器官可以分泌生理效应截然相反的两种激素，为理解血糖调节的机制奠定了基础。
2．细胞生物学方面的研究
1948年初，德迪夫按原计划从美国圣路易斯回国,途中经过纽约，访问了洛克菲勒医学研究所，受到比利时同胞克洛德(A.Claude)的热情招待，并结识了克洛德的学生－帕拉德(G. Palade)。那时，德迪夫无法想到他们三人将来会一起分享科学界的最高荣誉。在路克菲勒医学研究所，德迪夫了解到细胞生物学的最新进展，也对克洛德的研究工作有所了解。
20世纪上半叶，细胞仍被看作神秘且无法详细研究的实体，光学显微镜可展现细胞基本结构，即细胞膜、细胞质和细胞核,尽管已鉴定部分亚细胞器，如线粒体和高尔基体等，但无法获得更精细结构，这就阻碍了细胞功能的研究。真正的突破来自克洛德的一系列奠基性工作。
1930 年代，克洛德发明细胞组分分级分离（cell fractionation）技术，利用该技术将细胞色素氧化酶、琥珀酸氧化酶和细胞色素c等定位于线粒体，从而确定了线粒体是细胞氧化的主要场所。1940年代中期，细胞组分分级分离逐渐成为亚细胞结构研究的必要手段之一。1944年，克洛德又与波特(K. R. Porter)等合作，得到了第一张清晰的培养细胞电子显微镜照片，显示了细胞内多种精细结构，包括致密细胞核、不同长度线粒体、靠近细胞核的高尔基体以及充满细胞质的花纹状结构（后被命名为内质网）等。这次重大突破开启了现代细胞生物学的大门，为深入研究细胞精细结构莫定了基础。电子显徽镜亦很快成为细胞生物学研究的重要工具。细胞生物学的最新进展使德迪夫拓宽了视野并增长了见识，而克洛德、波特和帕拉德等洛克菲勒细胞生物学小组成员充满朝气的风格、非凡卓越的能力及丰硕的成果都给德迪夫留下了深刻印象，也对德迪夫将来的研究起了重要作用。

溶酶体的发现者－德迪夫（ChristiandeDuve）

分级分离技术
3．溶酶体的发现
1948年，德迪夫开始在勒芬大学担任教职，由于能力卓越，1951年升任教授。在勒芬大学，德迪夫一方面教授生物化学课，另一方面花费大量时间继续研究胰岛素的作用机制。德迪夫确定肝脏葡萄糖-6-磷酸酶在葡萄糖生成中发挥着关键作用，随后与学生探索胰岛素如何影响葡萄糖-6 -磷酸酶进而调节血糖。德迪夫首先将肝脏组织与蒸馏水混合，碾碎制备匀浆，利用蛋白质纯化技术获得需要的酶。然而，研究中遇到了重大麻烦,酶纯化后无法再次溶解，这为进一步的活性研究带来巨大障碍。为此，德迪夫放弃纯化思路，转而寻求细胞组分分级分离技术。结果发现，葡萄糖－6－磷酸酶主要在内质网部分发挥酶活性，后来该酶亦成为内质网的标志酶之一。
用组分代替纯酶为研究带来另一个问题，即需要保证每次实验酶量一致，为此将不参与糖代谢的酸性磷酸酶定为内部参照。然而采用细胞组分分级分离技术得到的酸性磷酸酶活性仅有用单纯酶纯化方法得到的10%。多次重复都获得类似结果。一次实验获得大量细胞组分，由于时间原因而暂时放置冰箱以备后续利用，五天后取出实验却惊奇地发现酶活性基本恢复。为避免操作误差，德迪夫让学生重复了实验，放置冰箱一段时间后检测，酶活性确实得到了恢复。德迪夫推测组分放置冰箱后，由于冻存而损伤膜式结构，因此导致这种膜式结构含有的酶释放而增加酶活性，据此认为酸性磷酸酶也是一种膜包被的酶。除冷藏外，冷冻、加热和添加去污剂等操作均可提升匀浆酸性磷酸酶活性，这些结果进一步印证了该酶定位于膜包被的细胞器。最初，德迪夫认为酸性磷酸酶定位于线粒体，但后来利用修改的克洛德方法将线粒体部分进一步分成轻重两部分 ,细胞色素氧化酶等典型线粒体标志酶富集在重部分，而酸性磷酸酶大部分集中在轻部分，由于位于线粒体和内质网中间，故命名为“中间微体”。到1955年，德迪夫共鉴定出5种“中间微体”标志酶，除酸性磷酸酶外，还有核糖核酸酶、组织蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和β-葡萄糖醛酸酶。由于这些酶主要参与水解反应，故将这一新细胞器命名为溶酶体（lysosome）。
1955年，在布鲁塞尔召开的第三届国际生化会议期间，电子显微镜专家诺维科夫(A. Novikoff)访问德迪夫实验室并开展合作。诺维科夫获得部分纯化溶酶体的清晰电子显微镜照片，照片显示了多个溶酶体结构。德迪夫和诺维科夫应用特异性酶染色，同时借助光学显微镜和电子显微镜证实酸性磷酸酶定位于溶酶体，进一步确定溶酶体是一种新细胞器。
今天，已鉴定出五十多种溶酶体特异酶，它们既发挥正常的细胞内消化功能，如对蛋白质、多糖、脂类和核酸等大分子的降解，又参与对人侵细菌、毒素、异常细胞产物和衰老细胞等相关组分的降解和重新利用，在多个细胞过程中发挥关键作用。因此，溶酶体内特定酶基因突变或功能异常可导致相关疾病发生，如糖原贮积症II型等。这些统称溶酶体贮积病，德迪夫提出可通过补充相关酶而实现疾病治疗，从而开启了“替代疗法”方案的时代。
德迪夫在研究溶酶体功能的过程中还发现了自噬现象。
1963年，德迪夫在溶酶体国际会议，上首次提出自噬概念，它是指细胞将自身物质消化的过程，以区别于细胞消化外源物质的异噬。自噬是真核细胞内关键的溶酶体通路，可用于降解和再利用大量细胞元件，如长寿命蛋白质和整个细胞器等。目前，细胞内共鉴定出三类自噬，即微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬从酵母到人广泛存在，且机制高度保守。自噬是细胞饥饿状态下获得营养物质以维持基本生存的方式；自噬还可清除细胞内错误折叠或功能异常蛋白质，也可清除衰老或有缺陷的细胞器;自噬还参与抵御微生物入侵的免疫应答过程中的抗原递呈等。自噬异常可导致多种疾病如肿瘤、衰老和心脑血管疾病等。目前，自噬已成为生命科学研究的前沿课题之一，拓展了对生命现象的理解和认识，为疾病治疗提供了新机遇，而德迪夫的贡献无疑是奠基性的。
4．过氧化物酶体发现
德迪夫还鉴定了另一细胞器－过氧化物酶体（peroxisome），加深了对亚细胞结构的理解和认识。
1954年，瑞典博士研究生罗丁（J.Rhodin）使用电子显微镜首先在小鼠肾小管中观察到直径约0.5微米且由单层膜包被的细胞器，根据形态将其命名为微体。随后在其他类型细胞中也观察到它的存在，但详细结构及生物功能不得而知。
1965年，德迪夫利用细胞组分分离技术从大鼠肝脏获得微体，由于对其标志酶和功能知之甚少，故仍沿用微体概念。德迪夫决定为它寻找一个更贴切的名称。由于研究发现微体可生成和降解过氧化氢，因此命名为过氧化物酶体，并暗示与细胞内氧化相关，过氧化氢酶碱性3,3'-二氨基联苯胺显色反应的引入为过氧化物酶体提供了特异性染色法，进-步在光学显微镜和电子显微镜下证实了德迪夫命名的正确性。
1968年，德迪夫和助手改进细胞组分分级分离技术，获得足够量的过氧化物酶体，溶酶体和线粒体三种细胞器。德迪夫研究了多种细胞过氧化物酶体，并对它们的精细形态进行详细描述，同时鉴定了大量过氧化物酶体的标志酶，奠定了过氧化物酶体研究的基础。
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