限制性核酸内切酶与DNA 连接酶

1 、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（ restriction endonuclease ）或简称为限制性酶（ restriction enzyme ）是指能识别双链 DNA 分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA 的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶可以降解外源的 DNA 分子，而细菌 DNA 甲基化，可以避免本身 DNA 分子被酶降解。这是生物的保护机制。
限制性酶可分成三类： I 类酶 结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的 DNA 。 III 类酶 在识别位点上切割 DNA 分子，然后从底物上解离。以上二类酶兼有切割和修饰（甲基化）的作用，并依赖于 ATP 的存在。 II 类酶 由二种酶组成，一种为限制性内切核酸酶，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。至今已分离出 600 多种 II 类酶。限制性内切酶在分子克隆中得到广泛应用，是重组 DNA 的基础。
II 型限制酶的识别序列通常由 4-8 个碱基对组成，这些碱基对的序列呈回文结构（ palindromic structure ），旋转 180 o ，其序列顺序不变。所有限制酶切割 DNA 后，均产生 5' 磷酸基和 3' 羟基的末端。限制酶作用所产生的 DNA 片段有以下两种形式：① 具有粘性末端（ cohesive end ），有些限制酶在识别序列上交错切割，结果形成的 DNA 限制片段具有粘性末端。例如， HindIII 切割结果形成 5' 单链突出的粘性末端，而 PstI 切割结果却形成 3' 单链突出的粘性末端。② 具有平末端 (blunt end) ，有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的 DNA 片段具有平末端。例如 Sma I 切割结果形成平末端。
Eco RI 的识别序列是： Sma I 的识别序列是：
5'- G _A A T T C – 3' 5' – C C C _G G G – 3'
3'- C T T A A_ G – 5' 3' –