Southern杂交
2011-10-08 17:25阅读：
为提高研究生对Southern杂交技术的学习与理解，设置了若干有关问答，请一年级新生徐东东当作业来完成，问题与回答如下。
答案基本通过。实验过程中遇到问题，还要参照分子克隆有关troubleshooting。
Q1：Southern杂交的基本原理是什么？应用范围？
原理：其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。基因组DNA首先用一种或几种限制性内切核酸酶消化，消化后的片段通过标准琼脂糖电泳按照大小进行分离。然后DNA经过原位杂交，从胶上转移到固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维素膜）。附着于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或者寡核苷酸探针 杂交，通过特定的检测方法如放射自显影可以确定与探针互补的带的位置。通过对经过不同限制性内切核酸酶（单一的或联合使用的）消化过的基因组
DNA、产生的条带的大小以及数量的估计，可以判断靶基因上下游限制性内切核酸酶的位置。
应用范围：利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
Q2：Southern杂交技术与PCR检测技术相比，优缺点是什么？
Southern杂交技术：
优点：方法灵敏，在理想条件下，用放射性同位素标记的探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ngDNA也能被清晰地检测出来。。
缺点：主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。Southern杂交要求的DNA纯度高。
PCR产物检测：
优点：PCR方法简单，容易操作；DNA纯度要求不是很高。
缺点：需要目标片段上、下游引物，通过扩增+琼脂糖电泳，会在指定的位置显现出来。
Q3：DNA提取过程中使用的CTAB的化学性质是什么？在DNA提取过程中作用？
100mMTris-7.5：提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；
700mMNaCL：NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中。
50mMEDTA
(8.0)：EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性
1%CTAB：CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
140mMβ-巯基乙醇：抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。
Q4：DNA提取过程中，β-巯基乙醇、苯酚/氯仿/异戊醇、异丙醇与乙醇等试剂的作用分别是什么？
β-巯基乙醇：抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。
苯酚/氯仿/异戊醇：反复抽提DNP（脱氧核糖核蛋白复合体），除去蛋白质。
异丙醇与乙醇：乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
Q5：DNA提取质量评估的方法有哪些，分别有什么优缺点？如何定量DNA？
1,DNA液测定230nm、260nm及280nm处的光吸收，OD260/OD280 比值大于2.0 ，表明有RNA污染；小于1.8 ，表明有蛋白质、酚等杂质。OD260/OD230比值大于2.0表明无小分子和盐类杂质干扰。这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。
2,荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
Q6：什么是DNA限制性内切酶？高等植物基因组DNA完全酶切后产物在变性分离胶中分布与形态是什么？DNA电泳的基本原理是什么？
内切酶是最关键的工具酶，是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。
高等植物基因组DNA完全酶切后产物在变性分离胶中分布与形态是：酶切完全的DNA进行琼脂糖凝胶电泳没有明显主带，呈弥散状，而且DNA在泳道中分布中间多，两头少
DNA电泳的基本原理：在电场的作用下，带有负电荷的DNA链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。
当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。
Q7：
TAE与TBE缓冲液系统有什么差异？应用的异同点？
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存
TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀。
TAE 与
TBE
缓冲溶液的成份如下：
50x TAE Buffer
(Tris-Acetate-EDTA)
242 g
Tris base
57.1 ml
Acetic acid 100ml
0.5M EDTA
Add ddH2O to 1 liter and adjust
pH to 8.5.
10x TBE Buffer
(Tris-Borate-EDTA)
108 g
Tris base
55 g
Boric acid
9.3 g
Na4EDTA
Add ddH2O to 1
liter.
The pH is 8.3 and requires no
adjustment.
TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较TBE缓冲液快，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。
Q8：简述虹吸法转膜的基本原理与物理学过程。
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。
DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度，小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移，而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
Q9：概述DNA变性与复性的过程。为什么在转膜前要进行变性与复性？
1.变性
加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性。
①DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只涉及二级结构改变，不伴随一级共价键的断裂。②DNA在紫外区260nm波长处的吸收光值变化。
2.复性
变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。
变性与复性的作用：为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
Q10：虹吸法转膜过程中注意事项是什么？
1，
转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
2，
凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。并且各层之间不能有气泡；,
3，
凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；
4，
整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。
Q11：随机标记探针是分别利用什么酶的什么活性来实现的？
通过Klenow酶的5'→3'聚合酶活性。
Q12：洗膜等过程中用到的SSC分别指什么？洗膜等过程中的严谨性高低可以通过怎么的浓度来实现？分别利用了这些物质的哪些物理与化学性质？
SSC（saline sodium
citrate）缓冲溶液是分子生物学中最标准的印迹和杂交处理溶液，其含有Sodium Chloride，Sodium Citrate。
洗液I（2×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC
100ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
洗液II（0.5×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC
25ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
洗液III（0.1×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC
5ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
主要用于核酸杂交，不同浓度作用不同：常用2×，及0.5×
·SSC缓冲液中的盐离子（Na ）中和DNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。
·2×SSC：高盐洗膜，洗去部分非特异性结合的探针。
·0.5×SSC：低盐洗膜，增加核酸链的严紧性，使得DNA/DNA之间的排斥力增加。
Q13：洗膜过程中的注意事项。
用不同组成及离子强度的（严谨度）溶液，洗去膜上的封闭剂及非特异性杂交的探针
1，
从低严谨度到高严谨度冼膜液。
2，
每次漂洗时要调换膜的顺序，以使每张膜漂洗的一致。
3，
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。
4，
用滤纸将杂交膜上的洗液吸干，然后用保鲜膜包好（尽可能除去保鲜膜内的空气）。洗膜过程中切忌将膜干燥。
Q14：压磷屏时，应把杂交过的膜的哪个面朝向磷屏的哪个面？
杂交膜的正面朝向磷屏。
Q15：影响Southern杂交的主要因素有哪些？
1，
DNA提取的质量。
2，
转膜的完全程度。
3，
转膜的效率。
4，
探针标记的效率。
5，
杂交和洗膜的效率。
6，
酶切效率、电泳分离效果、探针比活性和洗膜终止点等都影响southern杂交。
