五代十国之后，随着江南经济的发展，南京的地位亦随之日益重要起来。明初，南京一改过去只是统治半壁江山的政治中心，一跃而成为全国性的首都，这是南京在城市发展史上的第三个重要历史阶段。
元朝末年群雄割据，至正十六年（公元1356年。“至正”，元顺帝孛儿只斤妥懽铁睦尔的年号），朱元璋攻克集庆路（今南京），改为“应天府”，设置江南行中书省，作为自己的根据地。
明洪武元年（公元1368年），朱元璋建立明朝，定南京为首都，洪武十一年（公元1378年），又改南京为“京师”。
明永乐元年（公元1403年），朱元璋的四儿子燕王朱棣篡夺了政权，仍称南京，但永乐十九年（公元1421年），朱棣正式迁都北京，将南京降为“陪都”。不过，整个明朝，在南京仍保持着一套完整的政府机构。