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荧光分析技术

2008-10-21 09:19阅读:
一. 荧光分光光度计的主要部件
 由激发光源、激发单色器(置于样品池前)和发射单色器(置于样品池后)、样品池及检测系统组成。
其结构如图所示。
二 仪器的校正
(1)灵敏度校正:
 荧光分光光度计的灵敏度可用被检测出的最低信号来表示,或用某一对照品的稀溶液在一定激发波长光的照射下,能发射出最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。
 由于影响荧光分光光度计灵敏度的因素很多,同一型号的仪器,甚至同一台仪器在不同时间操作,所得的结果也不尽相同。
因而在每次测定时,在选定波长及狭缝宽度的条件下,先用一种稳定的荧光物质,配成浓度一致的对照品溶液对仪器进行校正,即每次将其荧光强度调节到相同数值(50%或100%)。如果被测物质所产生的荧光很稳定,自身就可作为对照品溶液。紫外-可见光范围内最常用的是1 μg/ml的硫酸奎宁对照品溶液(0.05 mol/L)硫酸中。
(2)波长校正:
若仪器的光学系统或检测器有所变动,或在较长时间使用之后,或在重要部件更换之后,应该用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度重新校正,这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。
(3)激发光谱和荧光光谱的校正:
用荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往存在较明显的误差,其原因较多,最主要的原因有:光源的强度随波长的改变而改变、每个检测器(如光电倍增管)对不同波长光的接受程度不同及检测器的感应与波长不呈线性。尤其是当波长处在检测器灵敏度曲线的陡坡时,误差最为显著。
因此,在用单光束荧光分光光度计时,先用仪器上附有的校正装置将每一波长的光源强度调整到一致,然后以表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的感应强度进行校正,以消除误差。目前生产的荧光分光光度计大多采用双光束光路,故可用参比光
束抵消光学误差。
三、荧光分析新技术简介
1.激光荧光分析 : 激光荧光法与一般荧光法的主要区别在于使用了单色性极好,强度更大的激光作为光源,因而大大提高了荧光分析法的灵敏度和选择性,特别是可调谐激光器用于分子荧光具有很突出的优点。
2.时间分辨荧光分析 是利用不同物质的荧光寿命不同,在激发和检测之间延缓的时间不同,以实现分别检测的目的。时间分辨荧光分析采用脉冲激光作为光源。如果选择合适的延缓时间,可测定被测组分的荧光而不受其他组分、杂质的荧光及噪声的干扰。目前已将时间分辨荧光法应用于免疫分析,发展成为时间分辨荧光免疫分析法。
3.同步荧光分析 在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值出△λ(通常选用与之差),同时扫描发射波长和激发波长,得到步荧光光谱。若以值相当于或大于斯托克斯位移,就能获得尖而窄的同步荧光峰。因荧光物质浓度与同步荧光峰峰高呈线性关系,故可用于定量分析,此法的灵敏度较高。
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1.
一般激发波长要比发射波长小5-10nm为宜。有人扫荧光发射时刚好相反,激发选250nm,却从220nm开始扫起,导致仪器总是出错,显示什么overflow。荧光物质的吸收峰和荧光发射峰之间是有些差别的,这个差别叫 stoke shift。与激发光波长相同的荧光叫共振荧光。瑞利散射和拉曼散射都不是荧光。建议楼主再仔细阅读陈国珍的荧光分析法(第二版)。
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2.在做荧光光谱时,在激发波长和激发波长整数倍的地方都会有瑞利散射,在激发波长几个纳米后还会有一个较弱的拉曼散射峰。判断的方法是改变激发光波长,两个散射峰会随着激发光波长的改变而改变,你真正的荧光峰只会发生强度的改变,峰位置不会有改变。
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3.并不是激发波长要比发射波长小多少。当然激发波长肯定是比发射波长小的。
通过荧光物质已知的发射峰,扫描它的激发光谱,可以得到最大激发波长。
然后以它的最大激发波长,扫描它的荧光发射光谱,这样荧光才最强。
Stokes shift 是 激发峰 与 发射峰 之间的距离,即最大激发波长与最大发射波长之间的波长差。Stokes shift 越大,瑞利效应越小。荧光物质的激发峰一般情况下在吸收峰附近。
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4.荧光发射的扫描范围,强调的是发射要从比激发波长大5-10nm的波段扫起。需要补充的是扫描范围最大也就是激发波长的二倍足以。
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5.荧光激发波长的选择,原则上说应该以紫外吸收峰为准。即在测荧光之前,须先做一些准备工作。在实际的选择上,在避开各种背景噪音的情况下,宜选取波长较长能量较低的光进行荧光激发。这一点必须着重强调!换句话说,最大激发波长一般是不用的,大多也在205-220nm之间,因为:这个波长的光能量太高,对反射镜(光源后面的那个镜子)和激发光栅、发射光栅以及后面的光电倍增管都是严重的摧残和虐待!
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此外还需要强调的是,在测荧光的时候,光源要不停开关的,所以在测的间隙建议随手关灯,以尽可能延长光源的寿命(一般是200-500h)。
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6.荧光强不一定是好事,我经常为荧光太强,超出测量的极限而头痛,往往意味着必须改光栅狭缝的大小,或者调节入射光的通量。如果是荧光物质本身的荧光效率很低,那根本就不用测荧光,因为影响荧光发射强度的因素太多了,什么都对它造成干扰。另外soaring0331知不知道荧光是没有单位的?它的强度只有相对的意义。
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http://emuch.net/html/200512/145765.html

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