利用流式细胞仪进行CD34绝对计数的ISHAGE指南
2009-01-20 21:02阅读：
ISHAGE方案的由来
随着今年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多，外周血造血干细胞的流式定量越来越成为一个突出的话题。如何准确地定量干细胞数量，什么是有效的质量控制成了各大实验室的话题。1989年，欧洲人创建了米兰方案，利用SS与CD34作双参数直方图，计算CD34阳性细胞数；同年，北欧人改进了米兰方案，加入了对照，称之米兰/北欧方案。1995年，血液病治疗及移植国际联合会(the International Society of
Hematotherapy and Graft
Engineering，ISHAGE)成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组，致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中的造血干细胞数量。这一方法必须是对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效，而
且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即在
96年问世的的
ISHAGE方案，至今为止，其他各种方案改进均以此方案为基础。
本文着重介绍ISHAGE方案及其设门步骤，并对其在近年来的改进型作了一定介绍
第一部分：关于ISHAGE方案及其改进方案
一、基本的ISHAGE：Dual
Plateform
如图(1)：
(1)CD45/SS。R1包括所有有CD45表达的细胞，包括dimCD45。R5为淋巴细胞
(2)CD34/SS。Gated from R1。
R2包括所有CD34+细胞，从低SS到中等SS强度
(3)CD45/SS。Gated from R1+R2
R3确认CD34阳性细胞位于低CD45与低SS区域，为真正CD34+细胞
(4)FS/SS，Gated from R1+R2+R3
R4用于去除低表达CD45以及CD34的聚集血小板影响
(5)CD45/CD34。
用于确认所有的CD45阳性细胞，确定R1的下限
(6)FS/SS。Gated from R4
R6包括了淋巴细胞，用于确定R3的FS下限
二, 改进： Single Plateform，见图2
(7)TIME/Flow Count
(8)Flow Count/FS
此二图用于作绝对计数。
三,
改进：StemOne 见图3
R7用于选择有活性的细胞。在此方案中，图4来自于R1+R2+R3+R7
第二部分：选用的试剂及其方法：
一、试剂
1，CD34与CD45：
到目前为止，建议使用的克隆为：
CD34-PE：581
CD45-PC5或CD45FITC：J33
2，Flow Count
FlowCount的性质：
P/N 7547053
200人份(1*20ml)
荧光微球
直径10um，激发波长488nm，发射波长范围从525nm至700nm。
3，NH4CL溶血素或Q-PREP试剂
二、使用方法：
1，溶血：标记后采用推荐的NH4CL或Q-PREP溶血，不再洗涤
2，Basic ISHAGE：采用BeckmanCoulter STKS计数
3，ISHAGE改进方案：Single Platform
(1)FlowCount 计数原理：
绝对计数(cells/ul)=
区域内的细胞数*FlowCount应用浓度
区域内的FlowCount数
(2)FlowCount 使用步骤：
v
标记全血标本
v
溶血
v
振荡FlowCount10~20秒
v
加入100ulFlowCount至反应试管，注意不要带入气泡
v
振荡试管5秒，上机前必须重复振荡一次
