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罗丹明123染色检测线粒体膜电位

2008-01-09 22:29阅读：1,939

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1300358207

一、检测原理：

罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光，可用荧光显微镜、荧光光度计或流式细胞仪检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。

二、 使用方法：

1． 细胞染色及分析
（1）培养细胞1×106/mL重悬于培养基中；
（2）加入罗丹明123染液0.1μg/mL～50 μg/mL （根椐细胞种类不同而浓度不同，一般3～10 μg/mL）；
（3）37℃，5% CO2细胞培养箱孵育1～30 min（根椐细胞种类不同而不同，一般10 min）；
（4）离心以培养基洗细胞两次；
（5）重悬细胞于培养基中，37℃，5% CO2培养60 min；
（6） 流式细胞仪检测：激发波长488～505nm，发射波长515～575 nm （一般为530
nm）；
荧光显微镜观察：滴加100 μL上述混合液于载玻片上，激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm观察，拍照。

2． 组织提取的线粒体染色及分析
（1）按常规方法提取的线粒体，用适量的1×Assays Buffer（将5×Assays Buffer 用水稀释5倍）重悬；
（2）常规方法进行蛋白含量测定后，用1×Assays Buffer调配成3mg/mL的线粒体溶液；
（3）取2mL 1×Assays Buffer和1mL线粒体溶液；
（4）加入适量待测化合物（同时设空白对照组），250C保温min；
（5）加入罗丹明123染液10 μL；
（6） 荧光光度计检测：上述混合液全部加入石英比色皿中，置于250C下测定，激发波长488～505nm，发射波长530nm，连续记录从0 min～30 min内荧光强度的变化。

三、储存 溶液置于－200C，可保存一年。

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