有仪器及试剂，收拾好自己所在的实验台；认真撰写实验报告和回答思考题，做到文字简明准确、绘图精致如实、图表简洁明了。及时上交实验报告。
10.
值日生扫好室内卫生，并检查水电、煤气等开关是否关好，防止发生安全事故。
三
、本课程的教学内容及时间分配表
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实验内容
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学时
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实验一
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培养基的配制与灭菌
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3
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实验二
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土壤中微生物的分离与纯化
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3
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实验三
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显微镜的使用维护及细菌形态的观察
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2
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实验四
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细菌的染色
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3
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实验五
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放线菌和真菌的形态观察
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3
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实验六
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微生物的大小测定及计数
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2
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实验七
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IMViC与硫化氢试验
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3
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实验八
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微生物的培养特征
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3
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实验九
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化学因素对微生物的影响
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3
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实验十
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多管发酵法测定水中大肠菌群
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5
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四、本课程的教学参考书
教材： 《微生物学实验》（第四版） 沈萍等主编，高等教育出版社，2007年。
参考书：1．《微生物学实验教程》 周德庆，高等教育出版社，2006年。
2．《微生物学实验》赵斌，科学出版社，2002年。
3．《微生物学实验教程》（第二版） 钱存柔,黄仪秀 北京大学出版社，2008年。
4．《微生物学实验技术》刘国生，科学出版社，2007年。
5．《微生物学实验指导》黄秀梨等，高等教育出版社，1999年。
6．《现代微生物学与实验技术》林稚兰黄秀梨主编，科学出版社，2004年。
7．《现代细菌培养基和生化实验手册》
郝士海，科学技术出版社，1992年。
实验一 培养基的配制与灭菌
[目的要求]
1．了解微生物培养基性质和配制方法。
2．熟悉微生物分离培养前的一些准备工作。
3．了解几种常用灭菌原理以及方法。
[基本内容]
1．
基本原理
2．
配制的方法及步骤
3．
灭菌方法及注意事项、
4．
分离微生物前的准备工作
[重点内容]
配制培养基的原理与方法
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
（一）培养基的配制
培养基——是按照微生物生长繁殖所需要的各种物质，用人工方法配制而成的一种基质（也就是讲，这种培养基是微生物的食物），培养基中含有C、N、无机盐、维生素以及水，这些成分提供了微生物能源以及新陈代谢中所起的调节作用，从而来合成细胞物质。由于微生物营养种类不同（营养类型不同），它们对营养物质的要求也各不相同。因此需要配制各种不同的培养基，以适应各种微生物对营养的要求。
配制培养基除了考虑上面提到的营养要求外，还需要考虑微生物生长的其它条件，如适应的酸碱度（PH），渗透压等。因此根据不同微生物对酸碱度的要求，需要将培养基调到一定的pH范围（象细菌和放线菌适应在偏碱性的条件下生长，一般在配制培养基时，将pH值调到7.2~7.6左右，而真菌适应在偏酸性的条件下生长，一般在配制时把培养基调到4.5~6.0，通常pH自然）。
其次根据培养基所选用的营养物质的来源不同，可将培养基分为：①天然培养基、②半合成培养基、③合成培养基；另外按照培养基物理形状的不同，可将培养基分为：①液体培养基、②固体培养基、③半固体培养基三种形状。固体培养基和液体培养基所含的营养成分相同，不同处，只是在液体培养基中加入一种凝固剂作支持物，我们通常用的支持物是1.5~2%的琼脂（洋菜），但也可用明胶和硅胶等。因明胶和硅胶容易被大部分微生物分解，因而不常用，以及根据培养基使用的目的不同，又将培养基分为：①繁殖培养基、②保存培养基、③加富培养基、④选择培养基、⑤鉴别培养基等。使用培养基的原则是根据不同的微生物和不同的目的来选择所需要的培养基。
（二）灭菌和消毒（disinfection & sterilization）
灭菌和消毒是微生物学实验中最常用的基本技术之一。
灭菌——是应用物理和化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物的细胞和芽孢。一般可用高温过滤或其它的物理、化学方法使器皿、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽孢完全杀死或除去。指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。
消毒——是应用物理和化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（特别是病原微生物），物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死，但已不致引起有害作用。一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体。
灭菌的方法可分为四大类：（1）加热灭菌、（2）过滤除菌、（3）辐射灭菌、（4）化学药品灭菌。虽然灭菌的方法有很多种，但由于灭菌的对象不同，实验的目的不同，所采用的灭菌方法也有所差别。例如，一般玻璃器皿可采用干热灭菌、培养基可采用高压蒸汽灭菌、对某些不耐高温的培养基则用间歇灭菌或过滤灭菌，无菌室、无菌罩等一般用紫外线或化学药剂处理，如甲醛喷雾或蒸熏等方法灭菌。
本实验只讲加热灭菌。加热灭菌又分为
干热灭菌和
湿热灭菌两类。
1.干热灭菌
干热灭菌又分为火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
（1）火焰烧灼灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，对接种环、接种针、玻棒或其它金属用具如镊子、解剖刀等采用此方法灭菌。
（2）干热灭菌（热空气灭菌）
是在电烤箱内利用高温干燥的热空气（160~170°C）使物体升温，然后导致物体上所带的微生物由于干热脱水（细胞内的蛋白质凝固变性）而死亡，这种方法常用于玻璃器皿等用具的灭菌。对于橡胶制品、塑料制品以及培养基等不能用此法灭菌。其过程如下：
①将要灭菌的器皿（培养皿、试管、吸管等）用报纸包扎好，放入烘箱内。
②接通电源，拨开开关，打开电烘箱排气孔，旋开恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100°C时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内温度停止加温，此时如果还未达到所需的160~170°C，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。旋动恒温调节器到160℃，当到此温时，借助于恒温调节的自动控制，保持恒温2小时。
③时间一到，关掉电源，当温度降到大约40~50℃（<70°C）后，打开箱门，取出器皿，并将调节器旋转到“0”。
注意事项：
①灭菌物品在箱内不能堆放的太满，一般不要超过总容器的2/3，灭菌物品之间应留有一定空隙。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以免包装纸烤焦起火。
②灭菌的器皿必须干燥，否则容易破裂。
③灭菌的温度不能超过180℃，否则棉花和纸等要烧焦，甚至发生事故，所以，在使用时，要随时检查温度情况，以防止自动恒稳调节器失调。
④灭菌后，如温度没降下就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器皿就破裂。
2.湿热灭菌
湿热灭菌又分为高压蒸气灭菌、常压蒸气灭菌、巴斯德消毒法、煮沸消毒法和超高温杀菌等。本实验只讲高压蒸汽灭菌。
高压蒸气灭菌是根据蒸气温度随压力的增加而提高，压力越大，温度越高的原理。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸气灭菌锅中进行的。在此密闭容器中，加热使灭菌锅隔套间的水沸腾产生水蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱除尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到了高于100℃的蒸气温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽温度。
一般将灭菌器中压力提高一个压力（即15磅/平方时或1.05公斤/平方厘米），灭菌15~30分钟，此时的温度是121.5℃，则可达到完全灭菌的要求。其过程如下：
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（
切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。）
②放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而投入棉塞。
③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称得方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
④打开加热开关，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间
。（灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力）
⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。(
压力一定要降到0时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者)
⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
（三）玻璃器皿的洗刷和包装
玻璃器皿使用前必须洗刷干净，三角瓶、试管、培养皿等浸入水中洗刷，用毛刷及去污粉或洗衣粉洗刷，然后用水冲净。
1.培养皿的包扎
在灭菌前可以将培养皿6套一组用报纸包装好，放入烘箱中灭菌。
2.吸管的包装
将洗过的吸管，在距其粗头顶端约0.5Cm处，塞一段1.5Cm长的棉花，以防止细菌吸入口中，同时也避免口中的微生物吹入培养基内，将塞好的棉花的吸管尖端放在4~5厘米宽的长纸条一端，约成45℃，折报纸包装尖端，并用左手握住吸管，右手将吸管压紧，在桌面上向前推动，以螺旋式包装起来，上端多余报纸折叠打结，准备灭菌。
3.棉塞的制备
棉塞所做的大小、形状、松紧要完全合适，要紧贴管壁，不留缝隙，正确的棉塞，头稍大些，约1/3在试管口外，2/3在试管口内，其制作的过程见实验书。
二、实验器材
每组：三种培养基各100ml分装三角瓶（90ml）和斜面试管（5ml）中，培养皿6套，吸管5支，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器（三角漏斗），天平，牛角匙，高压灭菌锅，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，报纸。
三、实验步骤
1．
玻璃器皿（培养皿、吸管）的洗刷和包装
2．
配制培养基（牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基和马丁氏培养基）50ml
称重→溶化→调pH→分装→包扎
3．
灭菌→无菌检查
[提问]
1．按成分的不同可将培养基分为哪几种？
2．按培养基的物理状态又分为哪几种？
3．牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号培养基是否要调pH？调到几？
4．培养基、无菌水等用哪种灭菌方法？
5．热空气灭菌所需要的时间和温度分别是多少？
2．热空气灭菌和高压蒸汽灭菌适应于哪些物品的灭菌？
准备工作：每组6个-7个人，一张纱布一团棉花，3个250ml三角瓶，一个100ml三角瓶并放玻璃珠，一个搪瓷缸和一根玻棒，6根棉线绳，6根18*180试管，18套培养皿，1根10ml吸管和洗耳球，3张报纸，裁好的报纸条牛皮纸4张，1ml吸管6根，一个带游码的天平，线球一个，配制培养基所需药品，牛角勺、ph试纸等。
操作步骤：第1、2组配制400-500ml牛肉膏蛋白胨培养基分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第3、4组配制高氏1号培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第5、6组配制马丁氏培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。每组每人装9ml自来水放入试管中，做一个棉塞，给带有玻璃珠的三角瓶加入45ml自来水，包培养皿3包每包6-7套（看每组人多少而定），每人包吸管一根，注上班级组号。
[作业]
见实验书。
实验二 土壤中微生物的分离与纯化
[目的要求]
1．初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏的基本方法。
2．练习微生物接种移殖和培养的基本技术。
[基本内容]
1．基本原理
2．分离纯化的操作技术步骤
3．微生物类群的鉴定与描述。
[重点内容]
分离纯化的基本操作技术。
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
（一）微生物的分离
微生物的分离是微生物学中的一个最重要的基本技术，因此要求熟练地掌握。
工农业及科学实验上所用的微生物菌种，最初都是从自然界筛选出来的。自然界的微生物种类非常多，分布极广，要从自然界找到我们需要的特殊菌种，就必须把它们从许许多多不同的杂种中分离出来。然后根据生长上的要求和菌种的特性，用各种不同的筛选方法，挑选出性能良好符合生产科研要求的纯种。
什么叫微生物的纯培养呢？就是在一种培养物中只生长一种微生物，而绝对没有其它微生物混杂其内，所产生的后代。
到什么地方可以采到含有我们所需要的菌种的样品呢？这要根据所需菌种的特性和其它有关因素而确定。一般地说，土壤中是菌种取样的主要源泉。但其它地方也有，如污水、动物粪便以及动植物的病原组织等也有大量的微生物存在。例如我们要筛选分解纤维素的微生物，首先就要考虑分解纤维素的微生物和纤维素的关系，纤维素是分解纤维素微生物的物质基础，离开纤维素就无所谓对纤维素进行什么分解了，因此要筛选分解纤维素的微生物就要到有纤维素腐烂的地方采集样品，才能筛选到分解纤维素的微生物。又如，要分离固氮菌，我们就要根据固氮菌生活的特性，到富有肥沃的pH偏碱的土壤中采样，这样就能分离出我们所需要的固氮菌。
在自然界中微生物几乎都是混杂在一起的，必须从土壤中或其它基质中将所需要的微生物分离出来供生产和考验的需要，由于微生物对营养、酸碱度、氧气的要求不同，当供给它们适当的生活环境条件，以有利于有些微生物的生长，又抑制或淘汰了其它杂菌。再用各种分离方法，使它们在固体培养基上形成单个菌落，便可得到纯种，常用的方法有稀释涂布平板法、平板划线法、单细胞挑取法、组织分离法等。
最常用的是稀释分离法，这种方法是将含有微生物的物质，用水稀释使一定量的液体中含有的微生物在固体培养基表面上发育成个别菌落的可能，然后再挑选单独的菌落。用无菌操作方法移殖在适应的培养基上，而获得纯种。分离的成功与否，决定于四个条件：（1）稀释度的选择；（2）营养条件；（3）环境条件；（4）操作过程是否严格遵守无菌手续。
（二）接种方法
微生物的接种方法，常用的有斜面接种、平面接种、液体接种、穿刺接种等。常用的接种工具有接种环、接种针、接种产铲、接种钩和三角玻璃棒等。不同接种方法，使用不同的接种工具。
接种是在接种室或净化工作台上进行，接种室或净化工作台事先用紫外线或化学药剂灭菌。
（三）微生物的培养
微生物的培养是微生物学一项重要的技术，培养方法有好气培养和厌气培养两种方法。真菌、放线菌和大多数细菌都是需要好气培养，厌气性细菌则相反，要求隔绝空气的条件下进行厌气培养。
（四）微生物的菌种保藏方法
微生物的菌种保藏是微生物学工作中的重要一环。
微生物菌种保藏是（1）保持菌种的生活能力，防止死亡；（2）保持菌种原来性状，防止变异退化；（3）保持菌种的纯培养防止污染。微生物菌种保藏的方法有多种，但不论何种保藏的方法，原则上要使微生物的代谢作用降至最低程度或处于休眠状态。所以从微生物来说，要利用它们的孢子或芽孢；从环境条件来说，要创造低温、干燥和隔绝空气这三个条件。
1.斜面冰箱保藏法
这是最简便的方法，待菌种充分生长后，放在冰箱内保藏（4℃左右），每隔一定时间再转移接到新鲜的培养基上以免死，一般有孢子的霉菌或放线菌以及有芽孢的细菌在冰箱中可保藏半年左右，酵母菌约4个月左右，球菌及无芽孢细菌月2个月。
2.石蜡油低温保藏法
在斜面菌种上加入无菌液体石蜡高出斜面1厘米，直立试管放入冰箱，可用于保藏细菌、放线菌。
3.砂土管保藏法
此法用于保藏孢子的放线菌、霉菌和产生芽孢的细菌。
4.冰冻真空干燥保藏法
此法将灭菌脱脂牛奶与细酵母菌细胞或霉菌、放线菌的孢子制成悬液，装入灭菌的安瓶内（不超过容积1/3），将安瓶放入冰、食盐混合物中，置冰箱中过夜，次日将安瓶通过脱水剂（五氧化二磷）接在抽气相上抽至真空。至菌液呈白色粉状，再在室温中抽气10分钟，用火焰将安萍密封，放在4℃冰箱内保存。
此法保存菌种可经数年，而不衰退，但手续比较麻烦。
在以上几种方法中，以冰箱保藏和石腊油低稳保藏最为简便，砂土管次之，冷冻干燥法最为复杂。
二、实验器材
每组：土样10g，装90ml无菌水的三角瓶，装9ml无菌水的试管5支，培养皿9套，无菌吸管等。
三、实验步骤
（1）制备土壤稀释液
称10克土样 → 90m无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中 →
摇动20分钟，静止半分钟，无菌吸管吸1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的大试管中水中 →
混合后从第1号试管（10
-2）吸1ml →第二号试管中用此法稀释至第五号试管 →
得到10
-1~10
-6土壤稀释液。
（2）用划线法分离土壤中细菌
用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 倒入细菌培养基成平板 →
凝固后用接种针（环）取10
-4和10
-5菌液一环 → 在平板上划线 →
倒置在28℃，培养2~3天观察移殖。
（3）用混菌法分离土壤中放线菌
用无菌培养皿一副 → 贴上标签 →
皿内一边加10%数滴，另一边加入0.1ml10
-2~10
-3土壤悬液
倒入已冷却至55~60℃左右的放线菌培养基摇匀 → 放入冷却 → 倒置在28℃培养，3~5天观察移殖。
（4）用涂布法分离真菌
用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 滴入2滴链霉素 → 倒入马丁氏培养基1管摇匀冷却 → 吸0.1 ml
10
-4或 10
-5土壤悬液放在平板上 → 用无菌三角玻璃棒涂匀 →
倒置28℃培养3~5天，观察移殖。
[提问]
1．什么叫微生物的纯培养？
2．分离微生物的方法有哪几种？
3．微生物保藏有哪些方法？
准备：每组准备一根涂棒两个接种环，两个酒精灯、将上次包好灭菌的培养皿放好，培养基融化等。
操作步骤：每人倒3个平板（3种培养基各一个），高氏1号要加5-8滴10%苯酚，马丁氏要加5-8滴1%链霉素。土壤稀释液制备：称取5克土样放入带玻璃珠的45ml三角瓶中，这是10-1，再从10-1取1ml放入另1支装有9ml的试管中变成10-2以此类推至10-5。用涂布法分离真菌和放线菌，取10-4或10-5的菌液0.2ml于平板中央用无菌玻璃涂棒涂匀，标注带分菌名及学号，倒置28度培养。划线法分离细菌：用无菌接种环沾取10-1的菌液一环在平板划线。
结尾：取出棉塞将试管、三角瓶洗干净，牛皮纸、线绳、玻璃珠回收。
[作业]
见实验书
实验三 显微镜的使用维护及细菌形态的观察
[目的要求]
1．复习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用维护方法。
2．学习并掌握油镜的原理和使用维护方法。
3．掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解细菌在光学显微镜下的基本形态特征。
[基本内容]
1．复习普通光学显微镜的结构及各部分的功能。
2．复习普通光学显微镜的使用、维护方法。
3．掌握油镜的原理和使用维护方法。
4．掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能。
5．了解细菌在光学显微镜下的基本形态特征。
[重点内容]
1. 油镜的原理和使用维护方法。
2. 利用显微镜观察不同微生物的基本技能。
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
2课时
[教学过程]
一、实验原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加镜油，这主要有以下两方面的原因：
1.增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间的加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油(通常用香柏油，其折射率n=1.52)。
2.增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：
式中：λ为光源光波波长，NA为物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为：
NA=n·sinθ
式中：θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离，一般来说在实际应用中物镜镜口角最大只能达到120°。而n为介质折射率，由于香柏油的折射率（1.52）比空气和水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2~1.4）要高于低倍镜、高倍镜等（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。
二、实验器材
1.菌种：金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌。
2.溶液和试剂：香柏油，二甲苯。
3.仪器和其他用品：普通光学显微镜，擦镜纸、绸布等。
三、实验步骤
1.观察前的准备
（1）显微镜的安置
置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。
（2）光源调节
将聚光器上升到最高位置，同事通过调节安装在镜座内的光源灯的电压获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明电源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。适当调节聚光器的高度也可改变视野的照明亮度，但一般情况下
（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜
双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或双眼视力有差异的观察者。
（4）聚光器数值孔径值的调节
调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。
2.显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的，在显微观察时应根据所观察微生物的大小选用不同的物镜。例如，观察酵母、放线菌、真菌等个体较大的微生物形态时，可选择低倍镜或高倍镜，而观察个体相对较小的细菌或微生物的细胞结构时，则应选用油镜，一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
（1）低倍镜观察
将要观察的标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，
聚光器不要打到最高，光圈、光亮也不要最大，再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必须养成好的调焦习惯：先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本。以防因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
（2）高倍镜观察
在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜视野中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦（parfocal）。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损害镜头或载玻片。
（3）油镜观察
在高倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。将聚光器升至最高位置并开足光圈、光亮，即三高，若所用聚光器的数值孔径值超过0.1，还应在聚光器与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
另一种常用的油镜观察方法是在低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，将油镜转到工作位置，然后在待观察的样品区域滴加香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径值及视野的照明强度后，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼镜捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外，应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
3.显微镜用毕后的处理及维护
（1）上升镜筒，取下载玻片
（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
注意：二甲苯等清洁剂会对镜头造成损伤，不要使用过量的清洁剂或让其在镜头上停留时间过长或有残留。此外，切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上汗渍、油物或产生划痕，影响观察。
（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4）将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭，或将反光镜垂直于镜座，将最低放大倍数的物镜转到工作位置，同时将载物台降到最低位置，并降下聚光器。
[提问]
1．用油镜观察时应注意哪些问题？
2．在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？
3．影响显微镜分辨率的因素有哪些？
4．什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
准备工作：上次学生自己分离的菌用显微镜观察。每人一张载玻片、一张吸水纸，每组一瓶0.85%生理盐水、香柏油、石碳酸复红、二甲苯等。
观察上次结果：三大类微生物菌落特征描述：1、大小，2、形态，3、透明程度，4、颜色，5、隆起程度。
油镜的使用(细菌的简单染色)：1、制片：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
2、观察：低镜→高倍镜→油镜观察。
3、用二甲苯、擦镜纸擦拭显微镜。
4、用铅笔画图并标上显微镜放大倍数。
5、使用油镜时要将聚光镜打到最高位置，
光圈打到最大，灯光打到最亮即三高。
16*100
实验四 细菌的染色（革兰氏染色）
[目的要求]
1．学习微生物涂片染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2．了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色的方法。
[基本内容]
1．染色的原理
2．涂片染色的基本技术及无菌操作技术
3．一般染色法
4．革兰氏染色法
5．观察芽孢、鞭毛、荚膜染色的示范片
[重点内容]
无菌操作技术及革兰氏染色方法
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
许多微生物，尤其是细菌，体积微小而且透明，当悬浮在液体内（如水滴内），它们折光率和悬液相差不大，因而，在显微镜下很不易看到它们，更谈不到识别其细胞结构，如采用染色技术，借助于颜色的反衬作用，就比较容易地看到它们。
用于细菌的染色是一些含有苯环为基本单位化合物，加上发色团和助色团，即成染料，发色团使化合物呈现颜色，苯环和发色团结合而成的化合物称为原色物，原色物不和被染物相结合，因此原色物不是一种染色剂，而只有在原色物上再加上一个助色团，因助色团具有电离作用，可以和被染物相结合，使被染物染上颜色。例如
为无色，但接上三个NO
2基后
就呈现黄色，NO
2是发色团，但在染色时还常具有助色团（在苯环上有一个能电离的基是带电核物质），解离后使整个染色带电核与细胞结合，因此细胞染上色。
根据助色团和发色团种类的不同，染料可分为碱性染料，酸性染料和复合染料。助色团解离后本身带正电核为碱性，能与酸性物质结合成盐，即为碱性染料。如结晶紫、碱性复红、蕃红、孔雀绿、次甲基兰（美兰）等。反之，助色团解离后带负电核，能与碱性物质结合成盐，即为酸性染料。如伊红、刚果红、酸性复红等。此外，有的染色剂具有一种性质，即能与碱性物质结合成盐，又能与酸性物质结合成盐，即成为复合染料，如基姆沙，苏丹染料。
众所周知，细菌的细胞主要是有蛋白质组成的，蛋白质中含有氨基酸，氨基酸是二性物质与碱性或酸性物质结合，由于细菌细胞中的氨基酸通常游离状态存在，容易和培养基中不同离子发生吸附作用，这些被吸附的离子若与染色剂中的离子相互交换（发生离子交换作用），则细菌着色。例如，一个带阴电的细菌与培养基中Mg离子相遇，则Mg离子被细菌所吸附。此时若加入碱性染料如美兰（MB
++CI
-），则Mg离子被染料中阳离子所取代，使细菌着色。
以上所讲的是一种吸附离子交换的假说。另外还有化学作用的假说，但我看吸附离子交换假说比较有说服力。
简单染色法是微生物工作中常用的染色方法，即用一种染色剂一次着色菌体，通过这种染色方法，可用于观察微生物的形状、大小以及细胞排列状态，此法是微生物技术中应用最广泛，操作简单的染色法。
革兰氏法是一种鉴别细菌的染色方法，根据各种细菌对这种染色反应的不同，可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。因为革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较多，肽聚糖含量较低，因而认为在革兰氏染色过程中脂溶剂乙醇的处理，溶解了脂类物质，结果使革兰氏阴性菌细胞壁增加了通透性，结晶紫—碘复合物亦被乙醇抽提出来，于是革兰氏阴性菌被脱色。革兰氏阳性军由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理中被脱水引起了细胞壁肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，结晶紫—碘的复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。此种染色方法是先用结晶紫染色，后加媒染剂碘液处理，再用脱色剂乙醇脱色，最后用蕃红进行复染，结果细菌能保持结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，仍保留其紫色的细菌叫革兰氏阳性菌，相反，能被乙醇脱色而又被蕃红复染上红色的细菌叫革兰氏阴性菌。
二、实验器材
1.菌种：金黄色葡萄球菌(16h)，枯草芽孢杆菌（12~18h），大肠杆菌(16h)。
2.溶液和试剂：草酸铵结晶紫染液，Lugol碘液，95%乙醇，番红复染液，齐氏石碳酸复红染液，无菌生理盐水，香柏油，二甲苯。
3.仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，接种环，镊子，普通光学显微镜，擦镜纸、吸水纸，绸布等。
三、实验步骤
1．简单染色法
清洁载玻片一块 → 中央滴生理盐水一滴 → 取葡萄球菌或枯草杆菌菌苔涂片 → 微微加热 → 干燥（固定）→ 涂片通过火焰3~4次 →
石碳酸复红染色 → 1分钟水洗 → 干燥 → 油镜观察并绘图。
2．革兰氏染色法
滴一滴生理盐水→取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌苔一起涂片 →
干燥 → 固定 → 结晶紫染色1~2min
水洗 → 碘液媒染1min → 水洗
→ 95%乙醇脱色 → 半分钟立既水洗 →
番红复染2~3min → 水洗 → 干燥
→ 油镜观察并绘图，并标上球菌是紫色，杆菌是淡红色和显微镜放大倍数。
注意：同学们在染色过程中，乙醇脱色必须严格掌握，如脱色过度，则阳性菌变成了阴性菌，而脱色不够时，阴性菌又被误染为阳性菌。
准备：每组0.85%生理盐水、香柏油、结晶紫、番红、碘液、95%乙醇、二甲苯各一瓶，每人一张载玻片一张吸水纸。
[提问]
1．细菌有哪些特殊结构？
2．细菌分哪两种反应？
3．在革兰氏染色过程中关键是哪一步？
4．实验所需要材料有哪些？
[作业]
16*100
16*100
见实验书。
实验五放线菌和真菌的形态观察
[目的要求]
1．学会用压片法观察放线菌的个体形态
2．学会用水浸法压片法观察酵母菌和霉菌的技术。
[基本内容]
1．基本原理
2．放线菌的制片与染色
3．霉菌的制片与染色
4．形态描绘
[重点内容]
放线菌和真菌形态特征的观察
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
1.放线菌的形态及染色
放线菌和细菌一样，都是单细胞微生物，由于它在抗菌素工业上占有重要地位，所以，一般都把它和细菌分开讲或作为一门课程而专门来讲。放线菌是单细胞的丝状体，一部分菌丝伸入培养基中，把这种菌丝叫基内菌丝，它是用来吸收培养基中的营养。另一部分菌丝长在培养基表面的称气生菌丝，气生菌丝的顶端分化为孢子丝，孢子丝有螺旋状、波浪状或直线状，孢子丝上再形成成串的或单个的分生孢子。孢子丝及分生孢子的形状、大小，因不同的放线菌而各异，是放线菌分类的重要依据之一。
放线菌制片时不采取涂片法，以免破坏细胞及菌丝体形态。通常采用插片法或玻璃纸法并结合菌丝体简单染色进行观察。在插片法中，首先将灭菌盖玻片插入接种有放线菌的平板，使放线菌沿盖玻片和培养基交接处生长而附着在盖玻片上，取出盖玻片可直接在显微镜下观察放线菌在自然生长状态下的形态特征，而且有利于对不同生长时期的放线菌进行观察。在玻璃纸法中，采用的玻璃纸是一种透明的半透膜，将放线菌菌种接种在覆盖在固体培养基表面的玻璃纸上，水分及小分子营养物质可透过玻璃纸被菌体吸收利用，而菌丝不能穿过玻璃纸而与培养基分离，观察时只要揭下玻璃纸转移到载玻片上，即可镜检观察。由于孢子丝形态、孢子排列及形状是放线菌重要的分类学指标，可采用印片法将放线菌菌落或菌苔表面的孢子丝印在载玻片上，经简单染色后观察。
2.霉菌的形态及染色
霉菌的形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，其细胞的平均宽度在3~10μm，用低倍镜和高倍镜就可以看清楚霉菌的形态结构霉菌的菌丝具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官，在观察时要注意观察菌丝提有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性孢子是怎样着生在孢子梗上的。
可以采用直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在盖玻片和载玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。对霉菌可利用乳酸石碳酸棉蓝染液进行染色，盖上盖玻片后制成霉菌制片镜检。石碳酸可以杀死菌体及孢子并可以防腐，乳酸可以保持菌体不变形，棉蓝使菌体着色。同时，这种霉菌制片不易干燥，能防止孢子飞散，用树胶封固后可制成永久标本长期保存。
二、实验器材
1.菌种：5406放线菌，黑曲霉，青霉，黑根霉，毛霉（培养5d）。
2.溶液和试剂：吕氏碱性美蓝染色，齐氏石碳酸复红染液，乳酸石碳酸棉蓝染液。
3.仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，接种针，接种环，解剖刀，解剖针，镊子，透明胶带，普通光学显微镜，擦镜纸、吸水纸等。
三、实验步骤
1.放线菌制片及简单染色
（1）插片法
①接种：无菌操作挑取放线菌菌种在高氏1号培养基平板上密集划线接种。
②插片：无菌操作用镊子取灭菌盖玻片以约45°角插入平板琼脂接种线上。
③培养：将平板倒置，于28℃培养3~5d。
④镜检：用镊子小心取出盖玻片，用纸擦去背面培养物，有菌面朝上放在载玻片上，通过显微镜直接用低倍镜和高倍镜镜检观察（在盖玻片菌体附着部位滴加0.1%吕氏碱性美蓝染色后观察效果更好。）
（2）印片法
①用解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片置火焰上微微加热，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）粘附（“印”）在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰2~3次固定。
②用石碳酸复红覆盖印迹，染色1分钟后水洗。
③干后用油镜观察并绘图。
2.霉菌制片及简单染色
（1）直接制片观察法
用解剖针从霉菌菌四丝边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，放在载玻片上先滴一滴生理盐水再滴一滴95%乙醇反复清洗几遍，盖上盖玻片，置低倍镜下观察（也可以滴一滴染液一般就不滴直接观察），必要时换高倍镜观察并绘图.
（2）透明胶带法
①滴一滴乳酸石碳酸棉蓝染液于载玻片上。
②用食指与拇指粘在一段透明胶带两端，使透明胶带呈U形，胶面朝下。
③将透明胶带胶面轻轻触及黑曲霉或黑根霉或青霉菌落表面。
④将粘在透明胶带上的菌体浸入载玻片上的乳酸石碳酸棉蓝染液中，并将透明胶带两端固定在载玻片两端，用低倍镜和高倍镜镜检。
[提问]
1．霉菌分为哪两种菌丝类型？
2．真菌分为哪三纲一类？哪五个亚门？
3．真菌的无性孢子和有性孢子有哪些？
4．本实验需要那些实验材料？
准备：每组0.85%生理盐水、香柏油、石碳酸复红、二甲苯、95%乙醇各一瓶，两根解剖针、一把解剖刀、生理盐水，菌种各一个，每人两张载玻片一张吸水纸。
[作业]
见实验书。
实验六 微生物大小测定及计数
[目的要求]
1．掌握用显微镜测微尺测量微生物大小的方法。
2．明确显微镜计数的原理，掌握血球计数板计数的方法。
[基本内容]
1．基本原理
2．微生物大小的测定
3．血球计数板计数的方法
4．其他计数的方法
[重点内容]
1．血球计数板计数的方法
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
2课时
[教学过程]
一、实验原理
（一）微生物大小的测定
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，同时也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定在显微镜下借助测微尺进行，测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺是一块可放入目镜中的圆形小玻璃片，其中央有精确的等分刻度，等分有50格和100格之分；物镜测微尺是中央刻有精确等分线的载玻片，通常其上是将1mm等份成100格，即每格为0.01mm（10µm），物镜测微尺是用来校正目镜测微尺每格刻度的；当我们将目镜测微尺放入接目镜中后用它测定微生物大小之前，我们必须先用物镜测微尺进行校正，由于不同的物镜和物镜组和的不同放大倍数会使目镜测微尺每格代表的实际长度不同，所以我们每换一次镜头（无论是物镜还是目镜）都要进行重新校正；在某一放大倍数下，我们可以根据目镜测微尺每格代表的相对长度和微生物细胞所占的目镜测微尺格数计算出细胞的实际长度。
（二）微生物数量的测定
单细胞微生物个体生长周期短，因此个体生长难以测定，所以我们常以群体生长作为微生物生长的指标，群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加；测定细胞物质的方法有测定细胞的干重、细胞某种成分的测定（如测氮的含量、DNA和RNA的含量测定）、代谢产物的测定。测定微生物数量的方法有很多种，象全数测定法中的直接计数法（血球计数板计数法）、比浊法和活菌测定法中的平板菌落计数法、液体稀释培养计数法。直接计数法和比浊法适应于总的微生物数量的计数。而平板菌落计数法和液体稀释培养计数法适应于微生物活的数量的计数。但通常所采用计数方法主要是直接计数法和平板菌落计数法。现在分别讨论每种计数方法的原理。
1.比浊法
比浊的原理是混浊的溶液能吸收光线，混浊度越大，吸收的光线越多，透过的光线越少。透过的光线通过光电池时，将光能变成电能，产生电流，可以由电流计读出数据，电流大小与光强度成正比。此法是用比浊计来测定或用一般光电比色计也可。
2.平板菌落计数法
其原理是将待测样品制成均匀一系列不同稀释度的稀释液（使样品中的微生物细胞充分分散成单个的细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中（特定的选择性培养基内），最后根据在平板上长出的菌落数计算每克样品中微生物数量。
平板菌落计数法包括了含菌样品稀释液的制备，平板接种培养，计数等几个步骤完成。
3.直接计数法
我们本次实验主要讲显微直接计数法中的血细胞计数板显微计数法，显微直接计数法是将少量待测样品悬液置于一种有特定面积和体积的一种载玻片中进行计数，它具有简便、直观、快速等优点，但是它区分不出死菌和活菌。血细胞计数板是计菌器的一种，它是一块特制的载玻片，其上有四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各有一个包含9个大方格的方格网，中间的大方格即为计数室，计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，中方格（周围为双线框）又分成16个小方格，另一种是一个大方格分成16个中方格，中方格又分成25个小方格，但是总的都有400个小方格，每个大方格的边长均为1mm，面积为1mm
2,盖上盖玻片后，盖片与载片间的高度为0.1mm，故计数室的容积为0.1mm
3（10
-4ml），计数时通常数五个中方格的总菌数，然后求其平均值，再乘以25或16即得一大方格的总菌数，最后换算成1ml菌液中的总菌数。
（1）16×
25的计数板
（2）25×
16的计数板
本实验所用的计数板是25×16规格的。
二、实验器材
1.菌种：酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌
2.仪器及其它用具：血细胞计数板、测微尺、显微镜、盖玻片、载玻片、吸水纸
三、
实验步骤
（一）测微尺测微生物大小
1.装目镜测微尺
取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
2.校正目镜测微尺
（1）镜台测微尺置于显微镜载物台上
（2）校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。
（3）计算目镜测微尺每格代表的长度
3.测定菌体的大小
取下目镜测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定藤黄微球菌的直径和大肠杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽或长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
测定酵母菌时，先将酵母培养物制成水浸片，然后用高倍镜测出宽和长各占目镜微尺的格数，最后，将测定的格数乘上目镜微尺每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。
4.记录结果、复原测微尺
（二）血细胞计数板计数
1.菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母稀释成100倍的菌悬液。
2.镜检计数室
在加样前一定要先对计数板的计数室进行镜检若有污物则要清洗，用绸布擦净（或电吹风吹干）。
3.加样品
将洁净的血细胞计数板盖上盖玻片，
摇匀酿酒酵母菌悬液后再用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
4.显微镜计数
加样后静置5min,然后将计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。计数时若发现菌液太浓或太稀则要重新调节稀释度，每小格约有5—10个为宜，若遇酵母出芽时，芽体达到母细胞的一半以上时则计为两个菌体计数，计数一样品时要以两个计数室中计得的平均数来计算样品的含菌量。
5.清洗血细胞计数板
计数完毕后将计数板在水龙头下冲洗干净，千万不要用硬物洗刷，洗完后放在指定的位置上让其自动晾干，镜检计数室的每一小格是否无污，若有则洗至干净为止。
6.注意事项
（1）使用计数板计数时，计数室是由25个中方格而每个中方格又分成16个小方格组成；或由16个中方格而每个中方格又分成25个小方格组成；无论是哪种小方格都是400个。我们用的是25个中方格计数板，中方格是由四周都是双线并且由16个小格组成。首先将显微镜聚光器打到最高以便找到计数室，找到计数室后一定要将聚光镜降至最低，光线调至较暗的状态才好观察。
（2）加样前一定要镜检计数板的计数室是否洁净。
（3）加样前一定要摇匀菌液。
（4）计数时对于位于格线上的菌体一般只计上方和右边线的，对出芽的酵母，若芽体达到母体一半以上时我们要计为两个菌体。计算公式见书。
（5）洗刷计数板时不能用硬物洗。
[提问]
1．用血球计数板测定微生物有什么优缺点。
2．计数时应注意哪些事项？
3．实验需要哪些材料？
[作业]
见实验书。
实验七 IMViC与硫化氢试验
[目的要求]
了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法
[基本内容]
1．各试验反应的原理
2．配制培养基与灭菌
3．各试验反应的方法
4．观察结果
[重点内容]
IMViC与硫化氢反应的原理及方法
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
IMViC是吲哚（indol
test）、甲基红(methyl red
test)、伏—普(Voges-Prokauer
test)和柠檬酸盐(citrate
test)四个试验的缩写，i是在英文中为了发音方面而加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气大肠杆菌，多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。
（1）吲哚试验。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌阴性。
（2）甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4.2（红色）~6.3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。
（3）伏—普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏—普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。产气肠杆菌伏—普反应阳性，大肠杆菌伏—普反应阴性。
（4）柠檬酸盐试验。有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气肠杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，在有1%溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0~7.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。
（5）硫化氢试验。也是检查肠道杆菌的生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，则形成黑色的硫化氢或硫化铁的沉淀物，从而可确定硫化氢的产生。大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。
二、实验器材
大肠杆菌、产气肠杆菌；蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基；甲基红试剂，40%KOH，5%α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。
蛋白胨水培养基：蛋白胨10克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升，PH7.6，121度灭菌20分钟。
葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5克，葡萄糖5克，磷酸氢二钾2克，蒸馏水1000毫升，PH7.0-7.2，112度灭菌30分钟。
醋酸铅培养基：PH7.4的牛肉膏蛋白胨100毫升，硫代硫酸钠0.25克，10%醋酸铅水溶液。将牛肉膏蛋白胨培养基100ml加热溶解，待冷却至60度时加入硫代硫酸钠0.25克，调至PH7.2，115度灭菌15分钟。剪滤纸条灭菌，将滤纸条浸入10%醋酸铅水溶液（无菌的）1ml，放入接好种的试管口塞上棉塞露出一半滤纸条在试管外。
三、实验步骤
1．接种与培养
（1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中，置37°C温室培养48小时。
（2）将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基中（做吲哚试验），置37°C温室培养48小时。
（3）将上述二菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中（做甲基红试验与伏—普试验），置37°C温室培养48小时。
（4）将上述二菌分别接种于2支柠檬酸盐斜面培养基中，置37°C温室培养48小时。
2．观察结果
（1）培养48小时后观察H
2S产生情况。
（2）吲哚试验。于培养48小时后的蛋白胨水培养物内加3~4滴乙醚，摇动数次，静置1~3分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
（3）甲基红试验培养48小时后，将葡萄糖蛋白胨水培养物分为2小管（其中一管留做伏—普试验），在一管内加甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。
（4）伏—普试验
在上述留下的一小试管培养物中加入40%KOH5~10滴，然后再加入等量的5%α-萘酚，用力振荡，再放入37温箱中保温15~30分钟，以加快反应速度。如培养物呈现红色者，为伏—普反应阳性。
（5）柠檬酸盐试验 培养48小时后观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。
[提问]
1．
IMViC的含义？
2．
吲哚试验、甲基红试验、伏—普试验、柠檬酸盐试验和硫化氢试验的基本原理分别是什么？
3．
IMViC试验和硫化氢试验的应用范围？
4．
各试验的操作步骤？
[作业]
见实验书
实验八 微生物的培养特征
[目的要求]
1．了解不同的微生物在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。
2．进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
[基本内容]
1．基本原理
2．掌握斜面接种、液体培养基接种和穿刺接种技术。
3．了解不同微生物在斜面上、液体培养基以及半固体培养基中的生长特征。
4．观察结果
[重点内容]
1．掌握斜面接种、液体培养基接种和穿刺接种技术。
2．了解不同微生物在斜面上、液体培养基以及半固体培养基中的生长特征。
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。
不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。固体培养基又分平板与斜面两种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等状况；它们培养在斜面培养基上，可以呈浑浊、絮状、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部显沉淀状；穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生长；也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚至不生长。微生物培养特征还包括菌苔的颜色、表面光滑程度、基质是否产生水溶性色素等。培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。
检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。
二、实验器材
牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体)
灭菌三角烧瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管、接种环、接种针、酒精灯等
三、实验步骤
1.斜面接种
（1）在牛肉膏蛋白胨斜面试管上会用记号笔表明待接种的菌种名称、株号、日期和接种者。
（2）点燃酒精灯或煤气灯。
（3）将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向上成水平状态，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。
（4）右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞（或试管帽）将其取出，并迅速烧灼管口。
（5）将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，使接种环的温度下降达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划一直线。所划直线尽可能地直，切莫划几条线或蛇形，不要将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口。
（6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼关口，并在火焰边将试管塞上。将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。
2.液体培养基接种
向牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种法相同，不同之处是挑取菌苔的接种环放入液体培养基试管后，应在液体表面处的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基，塞好试管塞后摇动试管，使菌体在培养液中分布均匀。
若向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可将无菌水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬液，再将菌悬液用塞有过滤棉花的无菌吸管定量吸出后加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出后加入或直接倒入液体培养基。整个接种过程都要求无菌操作。
3.穿刺接种
用接种针下端挑取菌种（针必须挺直），自半固体培养基的中心垂直刺入半固体培养基中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针退出，塞上试管塞，烧灼接种针。
4.培养及观察
将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置28~30℃温室培养2~3d后取出观察结果，并详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体培养基中的培养特征。
[提问]
1.
斜面接种、液体培养基接种及穿刺接种的要点是什么？
2.
接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却？
3.
用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？
[作业]
见实验书
实验九 化学因素对微生物的影响
[目的要求]
1．了解常用化学消毒剂对微生物的作用。
2．掌握测定化学消毒剂杀（抑）菌作用的滤纸片法。
[基本内容]
1．基本原理
2．滤纸片发测定化学消毒剂杀（抑）菌作用
3．了解常用化学消毒剂对微生物的杀（抑）菌作用
4．观察结果
[重点内容]
滤纸片发测定化学消毒剂杀（抑）菌作用
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
3课时
[教学过程]
一、实验原理
常用化学消毒剂主要有重金属及其盐类、有机溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。重金属离子可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基相结合而使酶失活，重金属盐则是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物；有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；染料在低浓度条件下可抑制细菌生长，染料对细菌的作用具有选择性，革兰氏阳性菌普遍比革兰氏阴性菌对染料更加敏感；表面活性剂能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使蛋白质发生变性。
各种化学消毒剂的杀菌能力常以石碳酸为标准，以石碳酸系数（酚系数）来表示。将某一消毒剂作不同程度稀释，在一定时间内及一定条件下，该消毒剂杀死全部供试微生物的最高稀释倍数与达到同样效果的石碳酸的最高稀释倍数的比值，即为该消毒剂对该种微生物的石碳酸系数。石碳酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。
二、实验器材
1.菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体)
3.溶液或试剂：2.5%碘酒，0.1%升汞，5%石碳酸，75%乙醇，100%乙醇，1%来苏尔，0.25%新洁尔灭，0.005%龙胆紫，0.05%龙胆紫，无菌生理盐水。
4.仪器或其他用具：无菌培养皿，无菌滤纸片，试管，吸管，三角涂棒等。
三、实验步骤
滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用
（1）将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。
（2）用无菌吸管吸取0.2mL培养18h的金黄色葡萄球菌菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。
（3）将已涂布好的平板底皿划分成4~6等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。
（4）用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片（D5mm）分别浸入装有各种消毒剂溶液的试管中浸湿。无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。
（5）将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃培养24h，取出观察抑（杀）菌圈的大小。
[提问]
1.滤纸片法测定杀（抑）菌作用的原理是什么？
2.滤纸片法操作的要点是什么？
[作业]
1.含化学消毒剂的滤纸片周围形成的抑（杀）菌圈标明该区域培养基中的原有细菌被杀死或被抑制而不能进行生长，你如何用实验证明抑（杀）菌圈的形成是由于化学消毒剂的抑菌作用还是杀菌作用？
2.影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小是否准确地反映出化学消毒剂抑（杀）菌能力的强弱？
3.在你的实验中，75%和100%的乙醇对金黄色葡萄球菌的作用效果有何不同？你知道医院常用的消毒剂的乙醇浓度是多少吗？请说明用此浓度乙醇的原因和机理？
4.某公司推出一种新型饮料，并声称是100%纯天然产品，不含防腐剂，利用你所掌握的微生物学知识，试设计一个简单实验来初步判断此饮料是否含防腐剂。
实验十 多管发酵法测定水中大肠菌群
[目的要求]
1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
[基本内容]
1．基本原理
2．多管发酵法
3．操作步骤
4．观察结果
[重点内容]
学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
[教学方法]
课堂讲授并演示
[课时安排]
5课时
[教学过程]
一、实验原理
大肠菌群（coliform group,total
coliforms）是以E.coli为代表的杆状、无芽孢、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性，经37℃、24~48h培养，发酵乳糖产酸产CO
2可区别于其他肠道细菌，易于测定的一类细菌。大肠菌群主要包括埃希氏菌属（Escherichia）、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。这类菌是温血动物肠道中的正常菌群，常随动物的粪便污染水源，一个成年人每天排泄出的粪便中含有（5~100）×10
10个这类细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌呈正相关性，而病原菌在水中浓度很低，测定手续繁琐，工作人员还有被感染传播的危险。因此，总大肠菌群是一个合适的指示菌，能指示出病原菌在水中的存在，其数量大于或等于病原菌的数量，并且比病原菌容易检出，所以检测水中的细菌学卫生标准，通常检测总大肠菌群。我国饮用水卫生标准规定每升水中总大肠菌群37℃培养48h小于3个。
大肠菌群指数高，表明水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染。测定大肠菌群的方法有多管发酵法、滤膜法和各种各样的快速、简便的微生物检测仪或试剂纸（盒或卡）等。多管发酵法为我国大多数环保、卫生和水厂等单位所采用，多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初步发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离
平板培养基一般使用远藤氏培养基（Endo’s medium）或伊红美蓝培养基(eosin methylene blue
agar，EMB培养基)，前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长，伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。
3．复发酵试验
将以上两次试验已证实为大肠菌群阳性的菌落，接种复发酵，其原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌群存在的初发酵管数目，查阅专用统计表，得出总大肠菌群指数。
二、实验器材
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管(瓶)
（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，无菌水。
载玻片，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
三、实验步骤
1．水样的采取
（1）自来水
先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水
应取距水面10~15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2.自来水检查
（1）初步发酵试验
在2个含有50mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100mL水样。在10支含有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10mL水样。混匀后37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
（2）平板分离
经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18~24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
①深紫黑色、有金属光泽。
②紫黑色、不带或略带金属光泽。
③淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1~3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。
3.池水、河水或湖水等的检查
（1）将水样稀释成10
-1与10
-2
（2）分别吸取1mL10
-2、10-1的稀释水样和1mL原水样，各注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0.1、0.01mL水样的发酵管结果查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
[提问]
1.何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属？
2.为什么远藤氏培养基和EMB培养基的琼脂平板，能够作为检测大肠菌群的鉴别平板？
3.什么是多管发酵法？其原理及操作要点是什么？
4.大肠杆菌在EMB培养基上典型菌落特征是什么？
5.什么是MPN法？其原理是什么？
6.我国饮用水卫生标准对大肠菌群的规定是怎样的？
[作业]
见实验书
显微镜的使用
1、首先根据需要安装好目镜、物镜和光源部分，将准备好的载玻片置于载物台上。
2、旋转物镜转换器，将物镜置于光路中，先自低倍开始，根据被观察物的特征，依次增高显微镜倍数。
3、每次观察前，先将物镜调至与载玻片最近距离处，再从目镜注视视野情况，缓慢由下向上调节升降螺旋至视野内出现物像后，再调节细螺旋，至物像清晰。
4、低倍镜的观察：旋转粗调节轮至距载玻片为0.3cm处，用左眼自目镜中观察（双筒者用双眼），同时旋转粗轮，使目镜上升，至视野清晰后，调节推进器观察载玻片，将欲观察部分移入视野中，一般来讲用低倍镜观察时光线不要太亮，聚光镜离载物台稍远一点。
5、高倍镜的观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节使物像清晰。
6、油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在样品区域滴加香柏油，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光镜升至最高位置并开足光圈，直至视野中出现物像清晰为止。
7、上升镜筒，取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸醮二甲苯擦去油，最后用干净的擦镜纸擦去二甲苯。再放回原处。
