酵母双杂交技术
2010-01-09 20:13阅读：
研究自噬还是用点新技术新方法，改进以往的套路：
（一）酵母双杂交系统的基本原理
酵母双杂交系统的建立与发展是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。真核生物中存在一种上游激活序列(upstream
activating sequence,
UAS)，其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。真核细胞转录起始需要反式转录激活因子的参与。很多真核生物的位点特异性转录激活因子是组件式的，通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异性结合结构域(DNA-binding
domain, BD)与转录激活结构域(transcriptional activation domain,
AD)。这两个结构域即使分开时仍各具功能，互不影响。但一个完整的某个特定基因的转录激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。只有将这两部分通过适当的途径在空间上接近才能恢复其激活转录的能力。不同来源的ＢＤ与ＡＤ结合后则特异地激活ＢＤ结合基因的表达。基于这一特性，Fields等设计了一个检测蛋白质与蛋白质相互作用的系统。选择的转录激活因子是酵母细胞中的GAL4蛋白。分离GAL4蛋白N端的1-147个氨基酸（BD）和C端的768-881个氨基酸（AD），分别构建重组质粒。如果在BD上接上一个蛋白X，在AD上接一个蛋白Y，再将这二个质粒共同导入酵母菌中，若X，Y蛋白在酵母内发生交互作用，则相当于将GAL4的BD和AD又连在一起，即可以转录激活下游报告基因的表达，通过测定报告基因的产物及活性来检测这种交互作用的发生（图4）。理论上，任何能在酵母中表达的基因均可作为报告基因，较为常用的是LacZ，和一些营养缺陷标记，这种报告基因只允许阳性克隆生长，最常用的是HIS3和LEU2。近来为了更灵敏、特异地筛选阳性克隆,常同时使用两种或两种以上的报告基因(如ADE2和URA3)，一则它可以允许用比单纯颜色筛选更大的菌落密度铺板，从而获得较丰富的表达产物，二则双重筛选相互验证，可以排除一些假阳性结果；三则转化体制造了大量的融合蛋白以保证基因产物满足生长需要，结果LacZ转录提高，从而β-半乳糖苷酶的活性亦增强。
图4 酵母双杂交基本原理示意图
完整的酵母双杂交系统由三个部分组成：与BD融合的蛋
白表达载体、与AD融合的蛋白表达载体、带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性,因此可以减少假阳性的出现。首先需要构建两种杂合反式作用载体，将蛋白质
A基因与报告基因转录因子的特异BD融合，成为“诱饵”(Bait)；将蛋白质B基因与特异的AD融合为“猎物”（prey）。当编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时，蛋白A与B之间若存在非共价作用，就会使AD与BD两结构域的相互接近，进而激活转录过程，使报告基因得到表达。
（二）酵母双杂交系统的特点及优点：
传统的研究蛋白质之间相互作用的方法很多，如交联、修饰、免疫共沉淀和亲合层析等，而且都是采用体外实验来研究蛋白与蛋白间的相互作用。因此在研究中往往受到许多外界实验条件、环境和方法的影响,而且对所研究蛋白的浓度和纯度要求很高,这样就导致了许多假阳性和假阴性实验结果，且无法准确研究蛋白之间微弱的相互作用。酵母双杂交系统则是采用体内实验来研究蛋白之间的相互作用，使研究方法发生了革命性的改变，它不受外界影响，方法精确，易于操作。更具特色的是所有操作均是在核酸水平上进行，无需纯化大量的蛋白，并可精确地测定蛋白质之间弱相互作用。归纳起来，酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：
1、敏感 双杂交系统的敏感度很高，可检测到蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。这是因为：融合蛋白在酵母细胞内的高水平表达，不仅仅是由于质粒的高拷贝数，还因为强启动子的控制可以促进融合蛋白的高效表达；AD和BD结合形成转录起始复合物，之后又与启动子DNA结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；转录过程中产生多种稳定的酶使信号放大；检测的结果可以是基因表达产物的累积效应，如酵母表型，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。而体外检测蛋白质相互作用，要经过一系列的洗涤过程，往往降低了信号。
2、简捷 用双杂交系统筛选cDNA文库时，可以简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，只需进行载体构建而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了蛋白抽提纯化等繁琐步骤。
3、高效酵母转化方法操作简单，转化率高，转化率可稳定在106个转化子/μg
DNA以上。酵母菌有很多的营养缺陷型标记，筛选比较方便，能够比较容易地从cDNA文库和基因组文库中直接筛选出蛋白质间的相互作用的阳性克隆。
4、真实 酵母是真核细胞，可以对表达的融合蛋白进行一些基本的修饰(如糖基化和磷酸化等)，表达的蛋白可在细胞核中产生交互作用。融合蛋白之间的作用是在真核细胞内进行，蛋白质经过转录及翻译后修饰，有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，因此所证实的蛋白质间相互作用将更接近体内的真实水平，作用条件与作用力无需模拟。检测在活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。
5、广泛 酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞浆细胞核及膜结合蛋白。以上特点决定了酵母双杂交系统最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，进而分析其功能。
（三）酵母双杂交系统的应用
酵母双杂交系统自产生以来，主要应用于下面几个方面：
1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用
利用双杂交系统可用来检测两个蛋白之间是否存在相互作用，只需将编码两个蛋白的DNA序列分别克隆至双杂交系统的载体中，即可通过检测报告基因是否表达从而论证这两个蛋白是否发生了交互作用。用传统的蛋白检测方法也能验证这种交互作用的发生，但双杂交系统的优点在于它的高灵敏度，而且反映了蛋白在体内的交互作用。如，在Aelst等所做的实验中，用双杂交系统能检测出免疫沉淀法无法检测到的Ras-Raf的交互作用，表明双杂交系统具有非常高的灵敏性，能检测出蛋白间微弱的相互作用，这是因为：①杂合蛋白一般是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白；②双杂交系统能检测出瞬间发生的信号反应，而一般的体外检测法蛋白则要经过一系列洗涤过程，往往导致交互作用不再发生；③融合蛋白的交互作用由于BD和DNA序列的相互结合变得更为稳定；④在转录过程中产生了一些复合酶使信号放大。
2、寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点
在证实两个蛋白捅形成交互作用后，可以对该蛋白进行缺失实验，通过缺失掉不同的片段来验证该蛋白在双杂交系统中是否仍具有激活转录的功能，从而对蛋白质中起作用的功能进行精确的定位，进而可以在相互作用的最小区域内进行DNA点突变，改变氨基酸序列，再测定突变体是否仍能激活报告基因的表达，从而找到交互作用的发生所必面的氨基酸残基。这是双杂交系统的特点所决定的，因为它是在DNA水平上表达蛋白质，只要缺失掉相应的DNA片段即可达到我们的目的，而传统的检测方法则无能为力。另外，通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能，例如Li等在p53和SV40大T抗原的结合实验中，对p53进行突变试验，发现突变型的p53失去了和T抗原结合的能力，这与一些癌症患者的p53蛋白发生的突变是一致的。
3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白
这是双杂交系统最广泛、最有价值的应用。将感兴趣的目标蛋白基因克隆至BD载体，而将要筛选的cDNA库克隆在AD载体，共同转化酵母宿主菌，如cDNA序列编码的某一段蛋白能和靶蛋白发生交互作用，则启动报告基因的转录，据此可以找到一个新的结合蛋白，使用双杂交系统筛选到的新蛋白已经相当多，并仍在继续扩大，这些蛋白在信号传导方面很可能扮演了重要角色。例如，由于PKC在细胞的发育和分化中所起的中心作用，Staudinger等将PKC的催化部分克隆到GAL4的BD作为“诱饵”来筛选小鼠T细胞的cDNA库，果然找到了一个新的蛋白PICK1，它和PKC的催化结构域专一性地发生交互作用，并用是PKC磷酸化作用的底物，对PICK1进行深入的研究将会使我们再清楚地了解和PKC有关的信号传导途径。
4、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
用酵母双杂交系统筛选与某种药物设计目标的蛋白分子相互作用的多肽，则筛选到的分子中可能会含有一些具有药物治疗作用的小分子多肽。Yang等证明了一段Leu-X-Cys-X-Glu肽可以与成视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白相互作用，为这项工作打下基础。
5、寻找调控蛋白质相互作用的化合物
确定两个蛋白质A、B具有相互作用以后，在恢复转录活性的双杂交系统中加入第3种物质C，再定量检测报告基因的表达强度，可以确定C对A、B之间相互作用的抑制或增强。Dixx通过APP蛋白重建了Gal4的转录活性，然后加入蛋白酶检测它是否可以切断蛋白，从而阻断Gal4的转录。若此蛋白酶的作用被证实，则还可加入第4种物质，来筛选蛋白酶的抑制剂。
6、绘制蛋白质相互作用图谱
随着基因组及后基因组计划的研究与发展，及各种mRNA在不同组织器官与生长发育不同阶段的分布（时空分布）图谱的构建，蛋白质相互作用图谱的绘制业已展开。在双杂交的AD与BD质粒中同时连入cDNA文库，进行库-库筛选，结合基因微点阵与生物信息学技术，则可以绘制出网状的蛋白联系图谱。
（六）酵母双杂交系统的拓展
国外学者为了拓宽传统的酵母双杂交的应用范围，在完善该系统的同时，创立了许多基于双杂交原理的新系统。目前应用较为成功的主要有：单杂交系统(One-hybrid
system)、三杂交系统(Three-hybrid system)和逆向双杂交系统(Reverse two hybrid
system)。
1、酵母单杂交系统主要用于研究蛋白质与ＤＮＡ间的相互作用。与双杂交不同之处在于与AD相融合的蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合，使AD直接激活下游报告基因的表达，这一过程无需BD-X的参与，故对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质，为转录因子的分离鉴定提供了有效的实验手段。
2、酵母三杂交系统研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用，按照第三个成分的不同，可以是蛋白质ＲＮＡ或小分子药物，如果是蛋白则与双杂交的候选条件相同，如果是RNA，则需构建成可以转录成待研究RNA的质粒；如果是小分子药物，可以用化学方法进行修饰。然后使这三种成分相互作用，通过观察下游报告基因的转录情况，判断这三者间是否存在相互作用。在三杂交体系中，杂交RNA分子可能不是生理结构，在体内共存于同一杂交RNA中，而且RNA只要形成部分正常结构，就可以介导转录激活作用。根据研究成分的不同三杂交系统可分为：蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统和RNA杂交系统。三杂交系统在调控机理研究、疾病防治等方面有广泛应用，还有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA之间相互作用。
3、反向双杂交体系确定蛋白质之间相互作用后，还要进一步研究其结构和功能的关系，确定蛋白质间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，特定结构尤为重要。反向双杂交体系的核心在于构建一种反向筛选的报告基因，即蛋白质间特异相互作用所激活的报告基因表达能阻碍转化体生长，从而发挥蛋白质间解离的选择环境。Vidal以毒性标志URA3为报告基因，BD-X和AD-Y的相互作用使毒性标志基因表达。这是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，其关键是报告基因的表达产物对细胞生长有抑制作用。这样当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时，表达出有毒性的报道蛋白，对野生型酶母产生毒性或致死性作用，细胞不能生长。而处于解离状态的BD-X和AD-Y的作用有助于酵母菌的生长。URA3的表达由含CAL4结合位点的启动子严密控制，此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中需GAL4的DNA结合结构域和转录激活结构域的融合蛋白相互作用，使URA3表达，其产物为合成尿嘧啶所必需，因此细胞能够存活。但此产物同时能催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为毒性产物5-氟尿嘧啶，因此在含有5-FOA
的培养基中BD-X和AD-Y具有相互作用的酵母菌不能生长，发生了蛋白质相互作用解离的菌株才能因表现出抗性而生存。根据这一原理，应用反向双杂交系统不仅能用于选择相互作用缺陷型的等位基因（即阻断蛋白质相互作用的突变体），还可用于鉴定抑制蛋白质相互作用的小分子。反向酵母双杂交系统还可作为研究体内功能的遗传学方法。临床上可以筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物，这也是当前及今后研究的热点之一。
酵母双杂交技术问世至今，已发展成为一种广为应用的鉴定分子相互作用的方法，并仍具有很大的发展潜力。这种技术及其拓展技术，必将在研究蛋白质功能、转录调节、基因功能定位和信号转导等领域发挥重要作用，促使我们更深入地理解细胞的活动和功能
