总RNA提取的原理、步骤
2008-10-06 15:20阅读:
一.原理及方法(异硫氰酸胍-酚-氯仿
一步法)
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
二.主要步骤
1.细胞或组织约60mg,加入TRNzol 1.5ml.匀浆。(匀浆器用75%Ethonol 泡五分钟,每匀一管样用75%酒精,DEPC水洗涤匀浆器)。
2. 10000rpm, 4℃,离心l0分钟,取上清(注意别吸入上层脂肪)。将1000ml上清转移到tube
3.加200 ml
氯仿,vertex 30s,ice cool
3min.
4. 10000rpm, 4℃,离心l5分钟,样品会分为三层:黄色有机相(DNA+PRO),中间(苯酚),上层水相,RNA就在水相中,转移约550微升到新TUBE里。
5.加入等体积的异丙醇,混匀,4℃放40分钟。
6. 10000rpm, 4℃,离心l0分钟,弃上清,离心前RNA沉淀通常看不见。
7.
向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀,吹打若干次。
8. 10000rpm, 4℃,离心5分钟,倒出液体,注意不要倒出沉淀,剩余的液体用枪头吸出。
9.室温放置晾干,3min,加入100微升的DEPC水,反复吹打混匀,充分溶解RNA.
10.测OD值。
11.制1%胶60ml,90V电压,15min,上样10微升(约200ngRNA)不用MARKER.
注意:经常更换手套。配制溶液的水都是无RNase的水,即DEPC水。所有工具都是RNA-special.