微生物综合实验：环境因素对微生物生长的影响
2010-01-02 13:27阅读：
综合实验：环境因素对微生物生长的影响
schdreamfly
1实验目的：①了解温度、渗透压及ph等因素对微生物生长的影响
②了解抗生素对微生物生长的影响，了解抗菌谱实验的基本方法
③了解常用化学消毒剂对微生物生长的影响以及抑菌圈大小的计算
③熟练掌握培养基与培养液的制作方法
③学会比浊法和菌落计数法观察菌种生长状况
④熟练掌握平板划线法、平板涂布法以及培养液的细菌接种过程。
2.
实验原理：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，
环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。物理、化学、生物及营
养等不同环境因素影响微生物生长繁殖的机制不尽相同，而不同类型为生物对同一环境
因素的适应能力也有差别。
Ⅰ、温度：温度对微生物细胞的生物大分子稳定性、酶的活性、细胞膜的流动性等方面有重要影响。过高的温度会导致蛋白质（酶）及核酸变性失活，细胞膜破坏等，而过低温度会使酶活性受抑制，细胞新陈代谢活动减弱。因此每种微生物只能在一定温度范围内生长，都具有自己的最低、最适和最高生长温度。（大肠杆菌的最适生长温度为37℃；嗜热脂肪芽孢杆菌最适生长温度为60~65℃）
Ⅱ、渗透压：微生物在等渗溶液中可以正常生长繁殖;在高渗溶液中细胞失水，生长受到抑制；在低渗溶液中，细胞吸水膨胀，因为大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，细胞一般不会裂解，可以正常生长，但在低渗溶液
中溶质（包括营养物质）含量低，在某些情况下也会影响微生物的生长。而不同类型微生物对渗透压变化的适应能力不尽相同。
（大肠杆菌在0.5~3%
NaCl条件下生长良好；盐沼盐杆菌在20~30% NaCl条件下生长良好）
Ⅲ、pH：pH过高或过低会使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，影响其生物活性，甚至导致变性失活，还可以引起细胞膜电荷变化，影响细胞对营养物质的吸收，同时还改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。因此，微生物都只能在一定的pH范围内生长。而不同类型微生物对pH变化的适应能力不尽相同.
(大肠杆菌的最适生长pH为6.0~7.0)
Ⅳ、生物因素（抗生素）：许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
（青霉素为窄谱抗生素，氨苄青霉素为广谱抗生素）
Ⅴ、化学消毒剂：常用化学消毒剂包括（酚、醇、醛等）、重金属盐、卤素元素及其化合物、染料和表面活性剂等。
（5%石碳酸、1%来苏尔、75%乙醇、0.25%新洁尔灭）
3.
实验器材：①菌种：实验室常用菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜
热脂肪芽孢杆菌
②培养基：Ⅰ、牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏，蛋白胨，NaCl,琼脂粉，水PH7.2~7.4）。
Ⅱ、牛肉膏蛋白胨培养液（同上，不加琼脂粉）根据实验步骤另行配制不同的nacl浓度、不同ph值的培养基。
③溶剂与试剂：生理盐水，蒸馏水，1NNaOH溶液，1NHCl溶液，青霉素溶液80万单位/ml，1%来苏尔，95%乙醇，碘酒。
④仪器与其他用品：酒精灯，接种环，玻璃棒，报纸，牛皮纸，皮筋，镊子，无菌平皿（31套），试管（11支）带塞子，1cm比色杯，分光光度计，无菌滤纸条，微量移液器（100ul一支）及枪头，滴管，无菌滤纸片，涂布棒，记号笔，高压蒸汽灭菌锅、三角瓶（100ml三个、200ml一个、1L一个），量筒2个（100ml一个，1000ml一个）
4.实验步骤：
一．
温度对微生物生长的影响
①
培养基：制作液体培养基9个，高压蒸汽灭菌。
② 标记：标记菌种大肠杆菌。
③
接种：用接种环取上述菌种，接种到培养基内。
④
培养：各取3支试管置于4℃、37℃和45℃条件下培养24h，测OD值。
二．
渗透压对微生物生长的影响
①
培养基：制作培养基时取一部分分别加入0.85%、5%、15%、25%NaCl，每个浓度三支试管，共12支试管。高压蒸汽灭菌。
② 标记：，标记菌种大肠杆菌
③
接种：用接种环分别取上述菌种，接种到培养基内（注意无菌操作）
④
培养、观察：37℃保温培养1天，测OD值。
三．
pH对微生物生长的影响
①
配制牛肉膏蛋白胨液体培养基：分别调pH至3.5、7.5、和11.5后分装试管，每种pH分装3管，每管5ml培养液，共9管，分装待用。
②
菌悬液的制备：制备菌液，取大肠杆菌斜面一支，挑取两环菌群至4毫升的无菌生理水中.
③
接种：无菌操作吸取0.1ml菌液，接种到每只试管中（将菌悬液充分震荡混匀）
④ 培养：37℃震荡培养1d
⑤
观察：光电比浊法测知菌液浓度的OD值，以此来判断大肠埃希氏菌最是生长的pH。
四． 生物因素（抗生素）对微生物生长的影响
①倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养及厚度均匀，需3个平板
②贴滤纸条：无菌操作，用镊子取无菌滤纸条进入青霉素溶液湿润，在容器内壁沥去多余溶液，再将滤纸条分别贴在平板上。
③接种：无菌操作，用接种环分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，从滤纸条边缘分别垂直向外划线接种（划线尽量靠近滤纸条，但不要接触）
④培养、观察：置于37℃保温培养1d，观察细菌生长状况并记录。
五．
化学消毒剂对微生物生长的影响（滤纸片法）
①菌液制备：无菌操作将金黄色葡萄球菌菌接种至装有5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37℃培养18h。
②倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）
③涂平板：无菌操作吸取0.2mL金黄色葡萄球菌菌液加入上述平板，用无菌三角涂棒涂布均匀。
④标记：将上述平板皿底用记号笔分成三等分，分别标明一种消毒剂名称
⑤贴滤纸片：无菌操作，用镊子取无菌滤纸片分别浸入各种消毒剂（碘酒、1% 来
苏尔，95%乙醇）在容器内壁沥去多余液体，再将滤纸片分别贴在平
板上相应位置，在平板中央贴上仅有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。（不要在培养基
表面拖动滤纸片）
⑥培养，观察：将上述平板倒置于37℃保温培养1d，观察并记录抑（杀）菌圈大小
5．实验操作安排：
第一天(周一)：领取实验用品，配培养基，高压蒸汽灭菌。
①
领取所需的菌种，器械，药品。
② 玻璃仪器的灭菌
12支（NaCl浓度不同，每浓度3支实验二用）
31套平板
2支（只放培养基，OD调零及实验五
菌液制备）
9支（PH不同，每PH3支，实验三用）
9支（普通牛肉膏培养基，实验一用）
3套（普通牛肉膏培养基，实验五用）
7套平板
1套（放剪好的滤纸条6和滤纸片15）
3套（普通牛肉膏培养基，实验四用）
将上述平板，放入电热干燥箱灭菌，待用。
③配培养基及其灭菌：按照如下配方配置培养基
配方
|
|
培养基1
|
培养基2
|
培养基3
|
培养基4
|
培养基5
|
牛肉膏g
|
2.4
|
1.2
|
0.3
|
0.3
|
0.3
|
蛋白胨g
|
8
|
4
|
1
|
1
|
1
|
NaClg
|
4
|
2
|
0.085
|
1.5
|
2.5
|
水ml
|
800
|
400
|
100
|
100
|
100
|
Ph
|
*
|
7.4-7.6
|
7.4-7.6
|
7.4-7.6
|
7.4-7.6
|
琼脂g
|
0
|
8
|
0
|
0
|
0
|
*：分装试管10支，三只PH为3.5，四只为7.5，三只为11.5。
④分装并调PH:将上述配好的培养基2调好PH后放入三角瓶中,封口并标记;其余培养基调PH后分装到各个试管中，封口并标记。
⑤高压蒸汽灭菌：将上述平板和试管放入高压蒸汽灭菌锅中高压蒸汽灭菌，放置待用。
第二天（周二）：接种，培养
A、观察平板及试管，长菌的平板及试管不可在实验使用
B、将实验一、二、三所用试管全部接入2环大肠杆菌。
C、试管按实验步骤分别放入4℃、37℃、60℃恒温培养箱中培养
D、将灭好菌的培养基2倒6套平板，放于无菌条件下待用(注意做好标记)
E、取一支装有培养基的试管，接入2环金黄色葡萄球菌，37℃培养18h。
F、取三套平板和已消毒的滤纸条，按实验步骤完成实验四，37℃培养24h
第三天（周三）：A
、取一支只装有培养基的试管用于OD调零，分别测所有试管的OD值并记录（注意测量前一定要充分摇匀培养基）
B、
观察实验四所用平板的细菌生长情况并记录
C、取出实验五所制菌液，取三套平板，涂平板，并按照实验步骤放上滤纸片37℃培养24h
第四天（周四）：观察实验五所用平板的抑菌圈观察及记录。清洗器械。并归还实验器械和药品
第五天~第七天(周五~周日)：结果分析，完成实验报告并提交。
6.实验记录
实验一
温度℃
|
OD值（平行1）
|
OD值（平行2）
|
OD值（平行3）
|
4℃
|
0.007
|
0.005
|
0.009
|
37℃
|
0.734
|
0.692
|
0.774
|
45℃
|
0.170
|
0.179
|
0.253
|
实验二
渗透压
|
OD值（平行1）
|
OD值（平行2）
|
OD值（平行3）
|
0.85%
|
0.229
|
0.295
|
0.279
|
5%
|
0.707
|
0.925
|
0.518
|
15%
|
0.256
|
0.211
|
0.246
|
25%
|
0.255
|
0.226
|
0.202
|
实验三
PH
|
OD值（平行1）
|
OD值（平行2）
|
OD值（平行3）
|
3.5
|
0.011
|
0.017
|
0.015
|
7.5
|
0.911
|
0.710
|
0.672
|
11.5
|
0.021
|
0.029
|
0.026
|
实验五
消毒剂
|
抑菌圈直径（1）
|
抑菌圈直径（2）
|
抑菌圈直径（3）
|
2.5%碘酒
|
3.2cm
|
4.5cm
|
4.4cm
|
95%乙醇
|
0cm
|
0cm
|
0cm
|
1%来苏尔
|
0.9cm
|
0.8cm
|
1.2cm
|
7.结果分析
实验一：由实验结果可以得出温度37℃最适合大肠杆菌的生长，4℃情况下大肠杆菌基本不生长，45℃大肠杆菌有所生长，但生长受到抑制。
实验二：由实验结果可以得出NaCl浓度为5%最适合大肠杆菌生长，其他NaCl浓度下大肠杆菌有所生长，但生长受到抑制。其中5%浓度下OD值偏差较大，很可能是测OD值之前培养基没用充分摇匀。
实验三：由实验结果可以得出PH=7.5最适合大肠杆菌生长，PH过高或过低大肠杆菌基本不生长。
实验四：青霉素对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
青霉素对大肠杆菌几乎没有抑制作用。
青霉素对枯草芽孢杆菌也几乎没有抑制，但抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用大。
因为青霉素为窄谱抗生素，只对革兰氏阳性菌有抑制作用。所以对大肠杆菌几乎没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑制作用较大。枯草芽孢杆菌也为革兰氏阳性菌，但是它的抗逆性较强，所以抑制作用不大。
实验五:2.5%碘酒的杀菌消毒效果最好，1%来苏尔次之，95%乙醇没有杀菌效果。
8.实验分析
这是我们第一次做创新实验，由于实验前对实验步骤考虑的不全面，导致实验过程中出现了一些漏洞和麻烦。比如没有想到进行菌种活化。但是实验结果还是符合事实的，所以实验还比较成功。
虽然实验比较简单，但是实验步骤很多，多个小实验穿插进行，所以我们学会实验前一定要进行全面的实验分析和设计。同时我们必须掌握各种微生物实验的基本技能。才能更好更快的完成实验。
