分子生物学实验中常见的问题与对策-4
2009-06-11 11:53阅读：
5 DNA的连接反应
5.1 TA克隆连接失败或效率低
可能原因：
（1）连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当
对策：使用一次性分装的缓冲液，避免反复冻融。提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。
（2）连接酶失活 对策：更换连接酶
（3）PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败
对策：将PCR产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物。
（4）PCR产物没有3’A突出端，不能连接
对策：使用能产生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR产物先通过聚合酶及dATP进行加尾反应产生3’A突出端，再与T载体连接。
（5）载体T突出端丢失，引起载体平端连接
对策：避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶。
（6）插入片段与载体比例不理想 对策：优化比例
5.2 粘端连接注意事项
（1）连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，
粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
（2）DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。
二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
（3）碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，
为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
（4）连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
（5）如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。
5.3 平端连接注意事项
（1）插入片断和载体片断的比例要高。
（2）连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。
（3）载体片断要做去磷酸化处理。
（4）可以用15％的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。
（5）反应体系10UL，不要太大。
（6）去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。
（7）插入片断和载体片断要酶切良好。
（8）低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。
5.4 用T4 DNA连接酶连接后转化失败
可能原因：
（1）反应体系内无ATP或Mg2+
对策：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
（2）反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高 对策：纯化DNA
（3）去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底
对策：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
（4）DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA
对策：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
（5）连接末端为单碱基突出末端
对策：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
（6）插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
（7）加入过多的连接混合物至感受态细胞
对策：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
（8）插入片段太大，不能进行环化
对策：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
（9）连接酶失活 对策：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
5.5 内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4
DNA连接酶连接和后续的转化失败
可能原因：
（1）内切酶酶切不充分
对策：假如酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。
（2）内切酶没有完全失活
对策：假如内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。
（3）内切酶的星号活性消化了载体或插入片段
对策：跑胶检测DNA，假如存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。
（4）DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端
对策：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注重事项，假如连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。
5.6 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？
可能原因：
（1）快速连接反应被热失活了，快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。
（2）快速连接混合液在电击之前没有纯化，快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。
对策：应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。
（3）过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。
（4）反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应 对策：纯化DNA。
（5）脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除
对策：可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃
5min即可完全失活而无需纯化DNA。
6 细菌的培养
6.1用氨苄抗性的选择培养基筛选转化细胞时，平板上没有克隆，有一层白色的浆状物，不均匀，像一层菌膜。
可能原因：氨苄无效或浓度过低，操作中引入杂菌；质粒没有转进去。
对策：重新转化质粒，更换氨苄。
6.2 工程菌的不稳定性及其对策
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素有关。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定。
就宿主而言，除了上述质粒中有同源序列外，还与宿主的比生长速率、宿主中重组基因（rec系统）的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。
在培养环境中高温、去垢剂（如SDS等）、某些药物（如利福平）、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失，因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性。
（1）组建合适载体
在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
（2）选择适当宿主
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，在选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
（3）施加选择压力
从遗传学来说，选择即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长。在重组DNA技术中，有好几方面利用选择压力，如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。①抗生素添加法②抗生素依赖变异法③营养缺陷法。
（4）控制基因过量表达
提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但许多研究发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，因此可采取分段培养法，即前期控制基因过量表达，使重组质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝、转录、翻译效率使外源基因高效表达。①利用阻遏—去阻遏启动子原理控制基因过量表达，②选择温度敏感型质粒控制基因过量表达。
（5）控制培养条件
重组菌所处的培养环境条件对其质粒的稳定性和表达效率等均具有很大的影响，当重组菌构建成功后，能否进入工业化生产阶段，其关键的步骤就是筛选最适的培养条件，包括培养基配方、培养温度、pH值范围，溶氧水平（好氧菌），添加选择压力和控制基因表达，实质也是通过培养条件的控制实现的。影响培养条件的因素很多，能影响菌体生长的所有培养工艺、工程参数都会影响质粒的稳定性，在这些工艺工程参数中，培养基成分、培养温度、菌体的比生长速率三个方面最为重要。
