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λ噬菌体的基因调控策略

2008-02-08 14:55阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1353047961

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核心与精华
λ噬菌体侵染细菌后，由于PL/OL和PR/OR上没有阻抑物cI的结合，所以细菌RNA聚合酶自PL和PR处开始转录并形成N蛋白和cro蛋白，转录终止于左右两侧的第一个启动子tL1和tR1；N蛋白发挥抗终止作用，使得转录越过左右两个终止子而转录cII和cIII；cII对于cI的产生是必需的，cII导致细菌的RNA聚合酶识别PRE启动子而向左转录，从而表达cI；“无中生有”的cI之后启动正调节回路，从PRM开始转录产生更多的cI，cI也结合到OL和OR，阻止N蛋白和cro的表达，使λ噬菌体维持溶源发育。

如果早早期基因表达翻译出的Cro蛋白与OR3结合，就能够停止从PRM处开始的阻抑物合成；Cro蛋白同时跟OR1或OR2，以及OL1或OL2结合，以下调基因表达。通过停止合成cII和cIII
蛋白，导致从PRE停止合成阻抑物cI；当不稳定的cII蛋白和cIII蛋白降解时，阻抑物回路就被关闭。
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λ噬菌体是一种感染大肠杆菌的温和噬菌体，侵染E.coli后既能进行复制和造成细菌裂解死亡，又能整合进入E. coli基因组并随着宿主基因组进行复制，进行溶源态生存。溶源发育尽管十分稳定，但是仍然可以通过一些损害宿主细胞的诱导剂使之诱导进入裂解感染。λ噬菌体的裂解发育、溶源发育和溶源发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达【Donald L. C. et. al., 2007】。

I．两种发育途径简介

λ噬菌体在裂解发育中的繁殖过程为吸附宿主、向宿主注射核酸物质、基因的复制和蛋白质的表达、宿主细胞的裂解和子代噬菌体的释放（如图1）。裂解发育通过使噬菌体的基因按照一定的顺序表达而完成，这样就保证了每种成分在生命周期适宜的时间表达。裂解周期可以分为两个主要的阶段：
早期感染—从噬菌体DNA进入宿主到开始复制的这一段时期，主要合成与DNA 复制有关的酶类，如参与DNA复制、重组和修饰的酶；
晚期感染—从复制开始到最后细胞裂解释放出子代噬菌体颗粒的过程，主要合成噬 菌体颗粒的蛋白质外壳，由于噬菌体需要许多不同的蛋白质外科组建成衣壳和尾，因此基因组的绝大部分是用于执行晚期功能的。
噬菌体基因表达的早期阶段只有少数基因表达，并且严重依赖宿主的转录机构，例如RNA聚合酶和σ因子。这些基因被成为早早期基因（immediate early gene）。第二类基因称为迟早期基因（delayed early gene）。裂解周期受到正调控作用，即每组基因只有受到恰当的信号刺激时才能启动表达。因此，早早期基因的表达编码了迟早期基因的调控蛋白，这种调控蛋白对于迟早期基因的表达是必需的。当噬菌体DNA开始复制时，晚期基因（late gene）开始表达。晚期基因的表达需要早早期或迟早期基因的编码产物作为信号，在λ噬菌体中，这种调控信号是一种抗终止因子。
因此，裂解性感染通常分为三个时期：第一个时期由宿主RNA聚合酶转录噬菌体早期的转录调控因子；第二个时期的基因在前一阶段表达的调控因子的作用下进行转录，此阶段表达的基因大多数为噬菌体复制所必须；第三个时期由编码噬菌体成分的基因组成，他们能够在第二个时期合成的调控因子的指导下转录。每个时期的基因都含有编码下一套基因表达所必须的转录因子基因，而本时期的基因表达也必然要受到上一阶段表达的转录因子的调控，这样裂解发育过程就形成了一种级联反应控制过程。
在级联反应中，上一阶段编码的转录调控因子对下一阶段的调控作用有几种不同的机制，调控因子可能是一种新的RNA聚合酶，或者是产生一种新的σ因子，从而使得RNA聚合酶在
本阶段识别不同的启动子并与之结合，开启不同的 Figure 1. 噬菌体典型的裂解周期
基因转录；调控因子也可以是一种抗终止因子，由于抗终止过程，是的RNA聚合酶不仅能够转录原来的基因片段，而且能够越过终止子通读随后的序列。两种机制的比较如下图。
Figure 2 左图上：由于终止子（terminator）的作用，RNA聚合酶只能转录终止子之前的基因；左突下：由于早期的转录产生的调控因子产生新的RNA聚合酶或新的σ因子，所以RNA聚合酶能够识别不同的启动子，启动下一时期的基因表达。右图上：RNA聚合酶只能转录终止子前的基因；右图下：由于前期基因表达的调节因子具有抗终止作用，因此，RNA聚合酶越过终止子通读后期的基因，造成前期和后期基因的共同表达。

在λ噬菌体中，控制早早期基因向迟早期基因表达的调控因子主要是通过抗终止子起作用的。

事实上，当λ噬菌体侵入细胞后，裂解和溶源途径是以同样的方式开始的，二者都需要早早期和迟早期基因的表达，之后两种途径产生分歧：若晚期基因得到表达，则启动裂解过程；若晚期基因受到抑制，则启动溶源发育。

II. 调控发育途径的分子基础

λ噬菌体的基因组为环状结构（Figure 3），其中与转录调节有关的基因有：PL, PR, OL, OR, tL1, tR1, cI, cro, nutR, nutL, cII, cIII, tR2, PRM, PRE等，各基因详细的功能将在下文叙述。

Figure 3 λ噬菌体基因图λ 噬菌体基因组为48502bp的环状DNA分子。图中，ORF是彩色盒装表示；启动子用三角形箭头表示；转录子用基因上方或下方的彩色线条表示；溶源发育所需基因用红色表示；早期裂解所需基因用绿色（从PR开始转录）和紫色（从PR’开始转录）表示。与细胞裂解和噬菌体头尾部有关蛋白的晚期基因转录子为紫色线条；整合和切除有关的基因（int和xis）转录子用桔黄色表示；；从cII激活的启动子出开始转录的基因用换色表示；黏合位点（cos）和噬菌体的结合位点(attP)用黑色圆环和矩形表示。

1. 两种途径共同的早期基因表达途径

λ噬菌体早早期基因只有两个N基因和cro基因，他们都是有宿主的RNA聚合酶编码的。N基因编码一种抗终止因子，它能够作用与nut位点，使得转录进入迟早期基因；cro基因的转录产物具有双重功能，既能阻止阻抑物的合成，也能关闭早早期基因的表达。迟早期基因具有两条用于复制的基因，7条用于重组的基因和3条用于编码的基因，其中调控基因中cII和cIII是合成阻抑物所必需的，调控因子Q是使宿主RNA聚合酶转录晚期基因的抗终止因子。
当λ噬菌体进入感染细胞后启动早早期基因的转录。宿主的RNA聚合酶结合左向和右向的启动子PL和PR结合并启动向左和向右的转录。向左转录终止于第一个终止子tL1，表达一种蛋白质pN；向右的转录终止于右侧的第一个终止子tR1，表达产物为Cro蛋白。两种表达产物都是一种转录调节蛋白。pN能够阻止终止子tL1和tR1的作用，使得转录越过这两个终止子而进入迟早期基因。迟早期基因表达导致蛋白质cII、cIII和Q的产生（基因Q是右向迟早期基因的最后一个，当基因Q产物不存在时，转录一段很短的序列就终止于一个终止子tR3；当pQ存在时，pQ能够抑制tR3的终止作用，使得RNA聚合酶越过tR3而进一步表达晚期基因）。在此，噬菌体可以走不同的分支途径：裂解发育或溶源发育。

2. 溶源发育中基因的相互作用
阻抑物由cI基因编码。cI通过与cI基因两侧的操纵子OL和OR的结合而阻止RNA聚合酶起始转录。

Figure 4 λ噬菌体具有复杂的调控区 当阻抑物cI与PL/QL和PR/QR结合，则抑制了早期基因的转录；否则早期基因得到转录和表达

cI与OL结合，阻止了RNA聚合酶从PL处起始转录，从而停止N基因的表达。由于所有的左向基因都使用启动子PL，所以cI阻止了所有左向基因的表达；cI与OR的结合除了能够阻止右向的基因表达之外，还能够激活RNA聚合酶自PRM向左启动转录，从而表达cI基因，这样阻抑物和cI基因建立起一个自主调控的正回路（又被成为阻抑物维持回路），这就解释了溶源态稳定存在的原因：只要阻抑物cI含量充分，cI基因就能够继续表达，结果就造成OL和OR长期被阻抑，使原噬菌体维持溶源状态。阻抑物的存在也解释了免疫现象的产生：如果有第二个噬菌体的DNA侵入溶源细胞，已存在的阻抑物立即与新基因组中的OL和OR结合，阻止了第二个噬菌体进入裂解周期。此外，高浓度的cI能够负调节自身，其机理是高浓度的阻抑物能够与OR3结合，阻止了PRM开始的转录（如图5）。
Figure 5 OR和OL的分区示意图 OR分为三个区：OR1, OR2, OR3; OL也分为三个区：OL1, OL2, OL3。PRM与OR3有重叠，所以cI与OR3的结合能够阻止从PRM处转录。

cII和cIII的存在对于溶源状态也是必需的。当λ噬菌体刚刚侵入时，由于没有阻抑物帮助细菌的RNA聚合酶结合到PRM，噬菌体（更精确说是细菌）不能合成cI。因此λ噬菌体干扰细菌时的第一件事是转录基因N和cro，此后pN使转录继续延伸，在左方，它使得cIII和其他基因转录；在右方，它使得cII转录。cII和cIII的存在使得cI的合成—“无中生有”—成为可能。Cro和cII基因间存在另一个启动子PRE，PRE只有在cII存在的情况下才能被RNA聚合酶识别并向左转录，转录出的mRNA能够十分有效的翻译出cI，一定浓度的cI就可以启动自身和cI基因的自主调控的正回路，产生更多的cI。
上述为cII启动溶源途径的一种机制，另一种机制为：cII引起了位于Q基因内的启动子PantiQ的转录，形成Q基因的mRNA的反义链，通过与mRNA杂交而阻止Q蛋白的翻译。前文已经讲过，Q蛋白的合成对于裂解也是必须的。

说明： 有关cI调控PR、PL和PRM更深入的研究
cI调控PR、PL和PRM的过程涉及到多种水平的协同效应，这些协同效应使得调节因子的调控更为高效。详见下图图示。
A




B






C





D

Figure 6. cI调控启动子PR、PL和PRM过程中的协同效应。cI单体（红色）结合成二聚体进而与操纵区OL和OR结合，临近的cI二聚体通过CTD相互作用形成四聚体（图B）。cI的结合阻止了RNA聚合酶向PR和PL的接近。但是OR2处结合的cI二聚体的NTD能够与RNA聚合酶σ亚基（结合到PRM的-35区）的σ4区（金黄色）相互作用，从而活化从PRM的转录（图C）。cI通过CTD进一步的作用通过促使长链DNA loop的形成而形成八聚体，使得cI能够协同的控制OR3和OL3，这样可以组织从PRM开始的转录（图D）。

Figure 7 溶源化的建立 早期基因得到转录，N和Cro蛋白产生；N蛋白发挥抗终止作用，产生cII和cIII; cII和cIII导致cI被表达；cI协助建立溶源态（详细内容见正文）


总结

如图7所示，λ噬菌体侵染细菌后，由于PL/OL和PR/OR上没有阻抑物cI的结合，所以细菌RNA聚合酶自PL和PR出开始转录并形成N蛋白和cro蛋白，转录终止于左右两侧的第一个启动子tL1和tR1；N蛋白发挥抗终止作用，使得转录越过左右两个终止子而转录cII和cIII；cII对于cI的产生是必需的，cII导致细菌的RNA聚合酶识别PRE启动子而向左转录，从而表达cI；“无中生有”的cI之后启动正调节回路，从PRM开始转录产生更多的cI，cI也结合到OL和OR，阻止N蛋白和cro的继续表达，从而维持溶源发育。

3. 裂解途径的建立

Cro基因对于λ噬菌体进入裂解周期具有关键做作用，其编码产物Cro蛋白能够阻止阻抑物的合成，从而消除了建立溶源状态的可能性。Cro蛋白形成小的二聚体，作用于免疫区，它能够通过维持回路阻止阻抑物的合成，也就是阻止经由PRM的转录，也能够抑制早期基因从PR和PL的表达，即当噬菌体进入裂解途径时，Cro蛋白负责阻止阻抑物的合成和抑制早期基因的表达。Cro蛋白具有和阻抑物类似的螺旋—转角—螺旋（helix-turn-helix），因此，而这能够识别并结合相同的区域。
以Cro蛋白与右向OR/PR的相互作用为例：Cro蛋白对OR3的亲和力要比对OR2和OR1的亲和力更强，所以它首先与OR3结合，这个结合抑制了RNA聚合酶与PRM的结合，所以Cro蛋白的第一个作用就是阻止溶源维持回路的运行。此后Cro蛋白与OR2或OR1结合，阻止RNA聚合酶利用PR，并进而停止产生早期功能产物，包括Cro蛋白本身。由于cII蛋白不稳定，PRE的作用也被停止，因此，Cro蛋白的这两种作用完全阻断了阻抑物的合成。由pQ激活晚期基因表达，这样噬菌体进入裂解途径。


4. 溶源和裂解的平衡
建立溶源态的起始时间是Cro蛋白在OL1和OR1处的结合。第二个位点的结合伴随这阻抑物二聚体在OL2和OR2处的协同结合，结果关闭了Cro蛋白的合成，并开始经由PRM进行阻抑物的合成。
进入裂解周期的起始事件是Cro蛋白在OR3出的结合，这就停止了PRM处开始的溶源维持回路。Cro蛋白必须和OR1或OR2，以及OL1或OL2结合，以下调基因表达。通过停止合成cII和cIII蛋白，导致从PRE停止合成阻抑物；当不稳定的cII蛋白和cIII蛋白降解时，阻抑物回路就被关闭。
因此，实现溶源和裂解间转变的关键是cII蛋白：如果cII蛋白是有活性的，经由PRE启动阻抑物合成是有效的，结果阻抑物占据操纵基因（cII也通过组织Q蛋白翻译而阻止后期基因表达）；如果cII蛋白没有活性，则不能合成阻抑物，Cro蛋白结合操纵基因。据认为，在宿主生理状态比较好，即营养条件比较适合，菌体代谢旺盛的情况下，cII蛋白没有活性，噬菌体倾向于进行裂解发育；而宿主生理状态不是很理想的状态下，cII蛋白有活性，能够启动溶源态的建立。

5. 溶源发育向裂解发育的转变
λ噬菌体可以由溶源状态向裂解状态转变。当受到之外先照射等外界因素影响时，细菌染色体受到较大程度的破坏，产生大量的双链DNA，激活Rec A，从而启动SOS反应。Rec A还具有切割λ噬菌体阻抑物cI的作用。通过将cI切割成单体而启动噬菌体的裂解过程。

III. 结论

综合以上信息，噬菌体的基因调控途径为：

噬菌体侵入后，立即从PL1和PR1开始转录，形成N蛋白和Cro蛋白；N蛋白是抗终止因子，导致cII和cIII的表达；cII开启从PRE开始的cI合成，从而建立阻抑物维持回路，噬菌体进入溶源状态；如果Cro蛋白与OR3结合，那么就能够切断阻抑物维持回路，并阻止早期基因表达，最终因为cII消失而进入裂解状态。

λ噬菌体侵染细菌后，由于PL/OL和PR/OR上没有阻抑物cI的结合，所以细菌RNA聚合酶自PL和PR处开始转录并形成N蛋白和cro蛋白，转录终止于左右两侧的第一个启动子tL1和tR1；N蛋白发挥抗终止作用，使得转录越过左右两个终止子而转录cII和cIII；cII对于cI的产生是必需的，cII导致细菌的RNA聚合酶识别PRE启动子而向左转录，从而表达cI；“无中生有”的cI之后启动正调节回路，从PRM开始转录产生更多的cI，cI也结合到OL和OR，阻止N蛋白和cro的表达，使λ噬菌体维持溶源发育。

如果早早期基因表达翻译出的Cro蛋白与OR3结合，就能够停止从PRM出开始的阻抑物合成；Cro蛋白同时跟OR1或OR2，以及OL1或OL2结合，以下调基因表达。通过停止合成cII和cIII蛋白，导致从PRE停止合成阻抑物；当不稳定的cII蛋白和cIII蛋白降解时，阻抑物回路就被关闭。

当启动SOS反应是，活化的RecA能够切割阻抑物cI，关闭溶源途径而启动裂解途径。

Ⅳ. 不足
虽然我花费了不少时间完善本文，尽量详细的解释λ噬菌体基因调控的方方面面，但是一方面是自己的能力和时间有限，另一方面是科学界对λ噬菌体基因调控的研究极其深入，其内容博大精深，所以必定有很多方面我不了解的。我自己认为本文的不足之处主要有：
1）有关调控物质的晶体结构及其由此推论出的调控物质与DNA和蛋白的相互作用机理没有涉及；
2）有关FtsH和其他蛋白酶对cII等调控物质的降解途径没有涉及到；
3）SOS反应启动后溶源途径向裂解途径转变的详细途径没有涉及。
除此之外，可能还有一些知识我没有涉及到，但是这已经超出我现在的能力了。希望能在以后的学习中逐渐补充和完善。
参考文献
  1. Lewin B.著, 余龙等译 基因 Ⅷ. 科学出版社，2005，北京
  2. lan B. D. et. al. Revisited gene regulation in bacteriophage λ. Curr. Opin. Genet. Dev. 15:145-152
  3. Max G. Bacteriophage λ: The Untold Story. J. Mol. Biol. 1999, 293: 177-180
  4. Donald L. C. et. al. A new look at Bacteriophage λgenetic networks. J. Bacteriol 2007, 189(2): 298 – 304
  5. Harrison E. et.al. Establishment and Maintenance of Repression by Bacteriophage Lambda: the role of the cI, cII and cIII proteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971, 68: 2190-2194
  6. Ronald A. A. et. al. How Cro and lambda-repressor distinguish between operators : the structural basis underlying a genetic switch. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998, 95: 3431-3436
说明：本文主要参考《基因Ⅷ》，文章大部分内容和图片参考本书；部分图片（Figure 3， 5，6）来自参考文献2；从文献3，4得到一些关于λ噬菌体的基本常识（如对于λ噬菌体对分子生物学研究的贡献）;文献5，6属于研究报告，从两篇文献中我了解了这些复杂的基因调控机理的研究过程。本文是总结性质的，从《基因Ⅷ》得到所需要的大部分原材料，最终的结论（即文章结论和开头精华部分）为自己看懂这一调控机理后用最精炼的话对λ噬菌体基因调控按照时间顺序进行的总结。

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