Western blot原理及实验方法
2008-03-17 19:07阅读：
Western blot原理及实验方法
一、 原理
Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质。“经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
二、操作步骤：
(一) 配胶
1、将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。封板时胶条的平面紧贴外侧玻璃板，凹面贴紧内侧玻璃板，放好后稍做调整，切忌用力拉动胶条。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。应贴紧垂直板的一侧向两玻璃板间灌入分离胶，切忌灌入气泡。
2、封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，建议用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立用滤纸吸干残留的液体，用同样的方法灌入配好的浓缩胶，插入梳子。整个灌胶的过程应避免有气泡产生。
3、灌好浓缩胶约30－60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。
(二) 样品处理
1．提取细胞（贴壁）蛋白
（1）弃上清，用PBS轻轻吹洗2－3遍。
（2）用EDTA消化（60mm培养皿约需1ml）约3－5分钟，能用移液枪吹洗下来即可。用1.5ml离心管收集细胞悬液，12000rmp离心1分钟。
（3）弃上清，向细胞中加入适量的裂解液RIPA（1×106cells约300ul）和蛋白酶抑制剂（注意此步骤以后都要保持冰上操作，保持低温）
（4）间断涡旋上述混合物约30分钟，使细胞充分裂解。
（5）离心，120
00rmp/分钟，10分钟，at 4℃
（6）取上清即为所提取的细胞蛋白。
（7）取蛋白上清加入loading buffer，沸水中煮3－5分钟，冷却后分装放－20℃保存。
2．蛋白定量（按申能博采试剂盒说明书操作）
(三) 电泳
1．抽出玻璃板之间的胶条，注意不要使胶与玻璃板之间有气泡。
2．向电泳槽中倒入电泳缓冲液，将胶板下的气泡赶走。
3．将加入loading
buffer的蛋白样品放沸水中煮5分钟，高速离心30s即可上样。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading
buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
4．先稳流35MA电泳至上下胶分界时改稳流45MA。当loading
buffer泳动到胶下缘时结束。电泳时间较长时，应用冰块放电泳槽两边防止溶胶。
(四) 转膜
将胶卸下，切除浓缩胶，右上切角标记，在转移液中稍稍浸泡一下，将与胶同样大小的NC膜，滤纸，海绵提前放在转移液中浸泡片刻。按顺序放四层滤纸，胶，NC膜，四层滤纸，用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分，两边放海绵，靠近胶的一面放负极，NC摸的一面放正极，转移槽中装满转移液，恒流350MA转移1.5小时（转移时间视蛋白分子量大小而定）。
注：为了防止溶胶，可将转移缓冲液提前放4℃冰箱预冷过夜，或将转移槽放冰浴中。
（五）染膜
转膜结束后取出NC膜先用丽春红染色观察蛋白条带，marker条带处用铅笔做好标记，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱
(六) 封闭及杂交
1．封闭：
将漂洗后的NC膜浸没于5％牛奶封闭液中缓慢摇荡2小时。TBST洗膜3次，每次10分钟
2．结合一抗：
一抗的准备：将一抗按适当的比例用抗体稀释液稀释。
将NC膜浸没于含有一抗的抗体稀释液中室温（25℃左右）轻摇3小时或放4℃冰箱过夜。
若放入4℃冰箱过夜则第二天还应放室温缓慢摇荡1小时。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器浸洗），每次10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗（HRP标记），按相应比例用抗体稀释液稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器），每次10min。
注：抗体稀释液稀释的一抗或二抗可回收重复利用数次，抗体稀释液稀释后的抗体可4℃保存约半个月时间。
(七) 发光鉴定（辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法）
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用TBST漂洗，滤纸贴角吸干，覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。
