鲜切蔬菜微生物污染总菌数检测方法
2011-02-21 12:00阅读：
病理研究
2006 年第6期
保鲜与加工
(总第37 期)
鲜切蔬菜微生物污染总菌数检测方法
许振,章炉军,陈春竹,徐玉兰,许玲
(华东师范大学生命科学学院,上海200062)
摘要：对鲜切蔬菜制品中总菌落数的测定方法进行了比较研究,总结出在制备鲜切蔬菜总菌数提取液时采用菜
样研磨取样、可调移液器代替玻璃移液管对提取液进行倍比稀释
,
稀释液涂板法37℃恒温培养48h,
可较为简便
和准确地检出鲜切蔬菜产品携带微生物总菌数。
关键词：鲜切蔬菜;菌落总数;食品安全;检验方法
MethodsofTestTotalNumber
ofContaminative
MicroorganismsofFresh-cutVegetables
XUZHen,ZHANGLu-jun,CHENCHun-zhu,XUYu-lan,XULing
(SchoolofLifeScience,EastChinaNormalUniversity,SHanghai200062,China)
Abstract:Various
methods
totestthe
total
number
ofcolonies
in
the
fresh-cut
vegetables
products
are
comparedin
the
paper.
One
comparativelyconvenientandaccuratemethodtotestthetotalamountofmicrobialcoloniesinfresh-cutvegetablesproductsarefound.
Thevegetablesamplesarefir
stground.Andtheadjustablevolumemechanicalpipetteinsteadofglass-madepipetteisusedwhendilutingthesample.Thenaserial5-folddilutionofthesampleismadeandsmearedontheplateculture,whichisincubatedat37℃for48h.
Keywords:fresh-cutvegetables;totalnumberofmicroorganisms;foodsafety;testingmethods
中图分类号：TS201.6
文献标识码：文章编号：
（
2006）06-0042-03
A
1009-6221
鲜切蔬菜(fresh-cutvegetable)
,
又可称为轻度加工或最法依据。
小加工鲜食蔬菜(minimallyprocessed
(MP)vegetable)[1]
。系
新鲜蔬菜经过精选、整理、清洗、切割、杀菌、包装等处理而
1
材料和方法
制成直接烹饪或直接食用的成品蔬菜,如色拉蔬菜等。鲜切
蔬菜制品除具有新鲜质地和营养价值外
,
还具有食用方便1.1
供试鲜切蔬菜
等优点,是现代蔬菜消费市场发展的方向[2]
。然而,鲜切蔬菜出口包装切割生菜为结球生菜(lettuce)
,
由上海金山
在加工切割过程中伴随着活细胞损伤、营养物质外漏
,
极易银龙蔬菜加工厂生产,4℃冰箱冷藏备用。
受到微生物的污染。适时监控鲜切蔬菜在加工和市场流通1.2
样品总菌数提取液制备
过程中总菌落数的变化,是衡量微生物污染动态、对产品进研磨法:无菌工作台内称取待测样品25g,
放入研钵中
行卫生学评价以及建立有效控制方法的重要依据。随着全充分研碎,移入装有225mL
生理盐水的三角瓶中充分振荡
球对鲜切蔬菜需求量的日益增加
,
因其带来的病原物群落摇匀
,
制备成1!10
的均匀稀释液备用;浸泡法
:
称取鲜切
的变化也将成为不可忽视的安全性问题[3,4]
。许多发达国家菜样品25g
放入装有225mL
生理盐水的三角瓶中浸泡10
已经对鲜切蔬菜制品制定了相应的检测标准
,
我国尚未对min,充分振荡,制备成1!10
的均匀稀释液备用。样品提取
鲜切蔬菜制品微生物检测标准做出相关规定。笔者参照我液的稀释与菌落检出方法同国家标准[5]
。试验设
3
次重复
,
国对普通食品微生物菌落总数检测标准GB4789.2-94
[6],将结果进行统计学分析。
鲜切蔬菜制品微生物总菌数的提取液制备、稀释以及在培1.3
样品提取液稀释方法比较
养基上的检出方法进行了对比研究
,
同时对菌落培养最适1.3.1
常规法[5,6]
主要器具有无菌1mL
玻璃移液管
5
支
,
培养基进行了选择
,
以期为快速检测鲜切蔬菜制品中微生15mL
试管5支。提取液稀释方法与国家标准相同。
物的污染程度
,
以及对产品进行准确的卫生学评价提供方1.3.2
改进法主要器具有1mL
和0.2mL
可调移液器各
1
基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字2004第
101号)
作者简介：许振(1986),男,汉族,上海人,大学在读,主要从
事采后病理研究工作.
支,1mL
和0.2mL
无菌吸头、1.5mL
塑料离心管各5支。移
液器菌液吸取1!10
均匀稀释液0.10mL,
沿管壁加入到含
有0.90mL
无菌水的1.5mL
塑料小离心管中
,
旋转振荡器
振荡均匀,制成1!100
稀释液,分别取1/10-3～10-53
个梯度
的稀释液0.10mL
检测总菌数,培养与平板计数方法同国家
病
标准[5]
。样品取样同上。测定鲜切蔬菜制品中菌落总数改进
理
法参见图1。
研
究
·-
图
1
改进法测定鲜切蔬菜制品中的菌落总数
1.4
样品总菌数提取液中菌落的检出
摇板法:无菌移液管取常规法制备的样品稀释液1×10-3、
1×10-4、1×10-53个梯度的稀释液1mL,加入无菌培养皿,再加
入15mL
已熔化并冷却至45℃的营养琼脂培养基(NA)混合
摇匀
,
待琼脂凝固后,37℃恒温培养48h,
取菌落数在30～
300
之间的培养平板按照国标法计数。涂板法:可调移液器
吸取0.10mL
各稀释液
,
加入提前制备好的固体NA
平板
,
无菌三角玻璃耙均匀涂板。菌落计数方法同国标法,菌落总
数用常用对数(log10)表示。
1.5
鲜切生菜菌落总数检测用培养基的比较与选择
分别制备
6
种常用培养基
,
制备方法如表1所示。其
中,NAL
的制备是在NA
培养基中加入4%
生菜汁提取液
图
2
研磨法与浸泡法对鲜切蔬菜样品总菌落数的提取效果
·-
图
3
常规稀释法与改进稀释法对总菌落数检出效果
2.3
稀释液摇板与涂板对鲜切蔬菜制品总菌数检出量的影响
1mL
样品稀释液与已熔化并冷却至45℃的NA
培养
基混合摇匀后培养结果
,
与直接吸取0.10mL
样品稀释液
涂板培养结果相比
,
各个检测时期检出总菌数均显著高于
摇板法(P<0.05),参见图4。
·-
后
,
经121℃高压灭菌20min
。PSA
为真菌培养基。
2
结果与分析
2.1
提取方法对鲜切蔬菜制品总菌数检出量的影响
采用样品直接浸泡与研磨两种方法对检验鲜切生菜总
菌数的提取方法进行了比较试验参见图2。结果表明,采用
菜体研磨提取比浸泡提取检出的菌落数明显增多(P<
0.05)
,
在研磨法与浸泡法比较的
3
个样品中
,
研磨法所检
验出的总菌数均多于浸泡法,其中
2
个样品有显著差异
,
另
第6卷第6期
图
4
摇板法与涂板法对鲜切蔬菜样品总菌数的检出效果比较
2.4
不同培养基对鲜切蔬菜总菌数检出量的影响
对6种常用微生物培养基进行了比较。为检测生菜表
面与内部含菌量
,
增加了在NAL
培养基模拟细菌生长环
境,检验生菜营养成分是否对离体后细菌的生长产生影响。
从表
2
中可以看出,PSA
与PCA
培养基单菌落检出数目极
显著地低于NA
培养基(P<0.01),不适宜应用。在加入生菜
汁的NAL
培养基上检出菌数高于普通NA
培养基;LB
培养
基检出量最高为5.62log10
·CFU/g,
虽然与NA
和NAL
相比
一个没有显著差异。
2.2
提取液稀释方法对鲜切蔬菜制品总菌数检出量的影响
通常样品提取液的稀释方法是在试管中进行
,
用移液
管进行操作[5]
。在分析检测大量样品时
,
玻璃移液管与试管
的用量较大,测定前后清洗与灭菌程序比较烦琐。笔者对样
品菌落提取液稀释法进行了改进
,
即将稀释过程在1.5mL
小离心管中进行,用可调移液器进行操作参见图3。改良后
的稀释法对鲜切生菜中总菌数的检出量与常规法无统计学
显著差异(P>0.05)。
表
1
总菌数检测用6种培养基
序号培养基种类制备1000mL
培养基主要成分
1
NA
(营养琼脂
)
牛肉膏粉3g,
蛋白胨10g,
琼脂粉13g,NaCl5g 2
NAL(营养琼脂+生菜汁
)
生菜汁4%,牛肉膏粉3g,蛋白胨10g,琼脂粉13g,NaCl5g 3
NB
(肉汤培养基
)
牛肉膏粉5g,
蛋白胨10g,
琼脂粉15g,NaCl5g 4
LB
(细菌培养基
)
酵母提取物5g,
蛋白胨10g,琼脂粉15g,NaCl10g 5
PSA(马铃薯培养基
)
马铃薯200g,
蔗糖20g,
琼脂粉15g 6
PCA(标准平板计数琼脂
)
酵母提取物2.5g,
胰酪胨6g,
琼脂粉13g,葡萄糖1g
注:NA+
生菜汁:4%
生菜(200mL
水+8g
菜)研磨取汁,加入800mLNA
中。
病·行业资讯
·
理
研开发羹类食品前景广阔
究
羹类食品是最易被人体消化吸收的食品之一。近年来
,
欧美一些国家与日本对羹类食品开发生产呈方兴未艾之势
,
但我国的食品行业在这一领域几乎还是空白。
羹类食品已被列入联合国卫生保健行业推荐食品之
一。因此,越来越多的国家和厂商争先涉足这一领域
,
以开
发生产多种系列的羹类食品
,
抢占国际市场。羹类食品项
目投资少、效益好
,
有关食品厂家只要对现有设备予以必
要的改造更新
,
便可生产。针对国际市场需求可供开发的
羹类食品有蔬菜系列——
—芦笋羹、土豆羹、辣椒羹、菜花
羹、白菜羹、无臭大蒜羹、芹菜羹、菠菜羹、茄子羹等。粮食
系列———玉米羹、大麦羹、麦芽羹、小米羹、麦片羹等。荤食
系列———羊肉羹、鸡羹、牛肉羹等。野味系列——
猪蹄羹、
—
野鸡羹、蛇羹、麝狸羹、—蚂
鸽子羹、海狸羹等。昆虫系列——
蚁羹、蝎子羹、蜘蛛羹、蝉羹等。
(山东枣庄山亭区商业园区119
号277201,沈瑞供稿
)
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!
2006
年第6期
保鲜
与
加工
(总第37
期
)
菌落检出量无统计学差异,但从菌落生长速度、大小形态以
及总量方面考虑具有一定的优势。
表26
种培养基对鲜切蔬菜样品总菌数的检出差异比较
样品号
NA
NB
NAL
PSA
LB
总菌数/log10·CFU·
g 1
PCA
平均值
M
5.26
5.53
5.62
5.18
4.66
4.61
最小值min
4.84
5.11
5.02
4.87
4.32
4.01
最大值max
5.79
5.85
6.34
5.74
4.85
5.06
标准偏差0.29
0.26
0.49
0.31
0.16
0.33
p值(Test)
-0.06
0.09
0.54
<0.01
<0.01
注:NA:
营养琼脂培养基;NAL:
生菜汁+NA;LB:
细菌
培养基;NB:
营养肉汤培养基;PSA:
马铃薯蔗糖培养基
;
PCA:
标准计数平板培养基;p值为各类培养基与NA
比较
T检验值。
3
结论
在美国由食物导致的疾病每年大约有7.6
亿件
,
其中
已知原因的有90%
以上由微生物污染引起
,
特别是近年来
的Escherichia
coliO157:H7
大肠菌等新型病原菌的污染
,
使国际社会对食品微生物的检测更加严格与规范。针对不
同类食品建立相应的微生物检验和评价方法是我国实现食
品安全保障国际化的重要课题。我国现行食品微生物总菌
数检验标准(GB4789.2-94)制定于1994
年
,
距今已经延用
了12
年。笔者对鲜切蔬菜制品表面附着微生物总菌数的提
取法、菌液的梯度稀释法、在平板培养基上的检出法以及最
佳培养基的种类进行了比较研究。总结出检测总菌数最佳
方法为25g
菜体无菌研磨,225mL
生理盐水浸泡5min,
提
取液采用可调移液器在1.5mL
离心管(dofe
管)中进行10
倍体积梯度稀释
,
分别取
3
种梯度的0.1
mL
稀释液
,
涂板
法在固体NA
或LB
平板培养基上涂板,37℃恒温培养48h
计数,可较准确地对鲜切蔬菜携带总菌数进行检测。
(1)在食品总菌数提取液的制备方法中
,
国家标准采用
浸泡震荡或研磨法。笔者在比较两种提取方法时发现,研磨
法虽在较浸泡法操作烦琐
,
但该法可以充分提取菜体内部
和附着性强的微生物,检出菌落的总数量显著高于浸泡法
,
所以在鲜切蔬菜的微生物检验中推荐使用该方法。
(2)笔者采用的稀释方法与国家标准相比
,
微生物检验
数量没有显著的差异,但用可调移液器代替玻璃移液管
,
用
塑料离心管代替玻璃试管
,
操作较简单且移液器吸头灭菌
方便无需回收,比较适合进行大量的微生物检测。
(3)在总菌数的检出方法中,国家标准采用的摇板法需
要严格控制培养基的温度
,
培养基温度过高会烫死一部分
微生物,太低又会出现摇板不均匀的现象,更需要操作经验
与熟练度。涂板法除了检出的微生物数量显著高于摇板法
,
微生物菌落形成时间早,能缩短检验时间,同类菌落形态均
一便于计数。建议鲜切蔬菜微生物检测中采用涂板法代替
摇板法。
(4)在检验培养基的比较中可以看出,NAL
和LB
培养
基上的菌落数均大于国家标准的NA
培养基
,
但无统计学
差异。在LB
培养基上的菌落生长速度快,菌落大小适中,且
检出数量较多
,
建议在鲜切蔬菜的微生物检测中采用LB
培养基。
上述检验方法与国家标准检测方法相比
,
在总菌数的
提取法、样品液稀释法以及在平板培养基上的检出方法等
均有针对性的改进。笔者为快速、准确地检验鲜切蔬菜制品
中微生物总菌数和监控微生物污染的变化提供了有益的方
法,也为今后制定相应的国家检验标准提供参考依据。
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北京:中国轻工业出版社,2004,
356—359.
注:许玲同志为本文通讯作者。
收稿日期：2006-09-08
